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产气荚膜梭菌PCR分型与肠毒素基因的克隆及序列分析

作　者: 唐源
导　师: 文明；李永明；周碧君；王开功
学　校: 贵州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 产气荚膜梭菌多重PCR 肠毒素基因筛选克隆序列分析
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 52次
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内容摘要

产气荚膜梭菌为一类革兰氏阳性产芽孢的厌氧梭菌,是一种重要的人畜共患病病原体,本试验对产气荚膜梭菌的研究包括四个方面:1.羊源产气荚膜梭菌贵州分离株多重PCR分型研究根据产气荚膜梭菌α、β、ε和τ毒素基因分别合成4对引物,建立多重PCR分型方法,对34株羊源产气荚膜梭菌贵州分离株进行血清型鉴定,结果在羊源产气荚膜梭菌贵州分离株中,属于产气荚膜梭菌A型的有32株,属C型和D型的各有1株,与前期的血清学方法鉴定结果一致。表明,这种多重PCR方法可以应用于产气荚膜梭菌临床分离株血清型的快速鉴定。2.产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌株的筛选与鉴定参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株(为C型菌株)扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%～100%,推导氨基酸同源性为98.7%～100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。由此可见,本试验从34株贵州分离株中筛选鉴定出一株产气荚膜梭菌cpe~+菌株(为C型菌株),为肠毒素全基因的克隆奠定了基础。3.C型产气荚膜梭菌肠毒素基因的克隆与序列分析参照国外发表的产气荚膜梭菌肠毒素全基因序列,设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对肠毒素阳性C型产气荚膜梭菌贵州分离株(CP2株)肠毒素基因进行扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体,并转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果显示,获得的基因序列全长960 bp,编码319个氨基酸。同源性分析表明贵州分离株CP2株与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列核苷酸同源性高达99.4%～99.8%,推导氨基酸同源性为99.1%～99.7%。这为进一步探讨肠毒素致病机理的研究奠定了分子基础。4.产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达载体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,提取质粒进行PCR和BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定后测序,结果表明本实验已将肠毒素基因克隆到原核表达载体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),这为肠毒素表达及表达产物生物学特性的研究奠定基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第一章羊源产气荚膜梭菌贵州分离株多重PCR分型研究  9-17
  1 材料和方法  9-12
  2 结果与分析  12-14
  3 讨论  14-15
  4 小结  15-17
第二章产气荚膜梭菌肠毒素阳性菌株的筛选与鉴定  17-23
  1 材料和方法  17-20
  2 结果与分析  20-21
  3 讨论  21-22
  4 小结  22-23
第三章 C型产气荚膜梭菌肠毒素基因的克隆与序列分析  23-30
  1 材料和方法  24-26
  2 结果与分析  26-27
  3 讨论  27-29
  4 小结  29-30
第四章产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建  30-41
  1 材料与方法  30-35
  2 结果与分析  35-37
  3 讨论  37-40
  5 小结  40-41
结论  41-42
文献综述  42-58
  1 产气荚膜梭菌简介  42-43
  2 产气荚膜梭菌的血清型与致病性  43-45
  3 产气荚膜梭菌主要毒力因子研究进展  45-55
    3.1 α毒素研究进展  45-47
    3.2 β毒素研究进展  47-49
    3.3 ε毒素研究进展  49-50
    3.4 ι毒素研究进展  50-51
    3.5 肠毒素研究进展  51-54
    3.6 β2毒素研究进展  54-55
  4 产气荚膜梭菌主要致病基因的检测  55-57
  5 研究的目的与意义  57-58
    5.1 多重PCR定型方法的目的与意义  57
    5.2 产气荚膜梭菌肠毒素基因的研究目的与意义  57-58
主要参考文献  58-64
附录一参与发表文章情况  64-65
附录二本试验用到的溶液、培养基、仪器和各种操作方法步骤  65-69
附录三本文用到的部分英文缩写及含义说明  69-70
致谢  70-71

产气荚膜梭菌PCR分型与肠毒素基因的克隆及序列分析

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