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十字花科黑腐病菌Ⅲ型分泌系统hpa基因功能的鉴定

作　者: 蒋国凤
导　师: 唐纪良；姜伯乐
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 十字花科黑腐病菌 hpa基因 效应物 致病性 过敏反应
分类号: S432.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


植物病原细菌通过hrp基因簇编码组装的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system，T3SS)将称之为Ⅲ型效应物的毒力蛋白分泌并转运至寄主细胞体内，调节或干扰寄主的正常生理活动，从而建立寄生关系或引起抗病反应。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．campestris，Xcc)的T3SS系统由hrp基因簇编码，尽管已知hrp和hrc(hrp conserved)基因编码高度保守的T3SS装置蛋白，一些hpa(hrp associated)基因的功能尚未知。本研究以Xcc 8004菌株为研究对象，首先，依据黄单胞菌的avrBs1对辣椒ECW-10R的Bs1互作机理，建立了一套快速、有效的Xcc效应物及分子伴侣的转运和分泌鉴定系统，然后，利用该系统鉴定Xcc 8004所有hpa基因(包括hpa1、hpa2、hpaB、hpaP、hpaA、XC3024)是否为效应物基因，结果未检测到这些Hpa蛋白的转运。利用自杀质粒pK18mob对这些hpa基因进行非极性整合突变，并检测突变体的致病性和过敏反应(HR)。结果表明hpa2、hpaP和hpaB突变体过敏反应完全丧失，hpaA过敏反应严重减弱，hpa1和XC3024突变体过敏反应基本不受影响；hpa2、hpa1和XC3024突变体的致病性基本不受影响，hpaA、hpaP和hpaB突变体致病性明显减弱。通过RT-PCR和gus报告基因检测hpa基因的表达调控，结果表明，这些hpa基因都在基本培养基(MMX)上高表达，且都受hrpG、hrpX正向调控。操纵子研究表明，hpa1、hpa2和hpaB具有独立的启动子，而hpaP、hpaA和XC3024不含独立的启动子。为检测hpa基因是否影响AvrXccAC(XC1553)等已知效应物的转运，将AvrXccAC等已知效应物的AvrBs1融合蛋白导入hpa基因突变体NK3001(hpa2)、NK3014(hpaP)和NK3022(hpaB)，结果表明，仅HpaB影响AvrXccAC等多个效应物的转运。表型检测结果显示，hpa基因不影响胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及胞外多糖的分泌，不影响泳动性。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-12
第一章 前言  12-36
  1.1 植物与病原菌相互作用的机理研究  12-19
    1.1.1 植物病原细菌的致病因子及编码致病因子的致病基因  12-15
      1.1.1.1 胞外多糖  13
      1.1.1.2 脂多糖  13-14
      1.1.1.3 胞外酶  14
      1.1.1.4 植物毒素  14-15
      1.1.1.5 三型分泌的效应物  15
    1.1.2 病原菌的分泌系统  15-19
      1.2.2.1 Ⅰ型分泌系统  16
      1.2.2.2 Ⅱ型分泌系统  16
      1.2.2.3 Ⅲ型分泌系统  16-18
      1.2.2.4 Ⅳ型分泌系统  18
      1.2.2.5 Ⅴ型分泌系统  18-19
  1.2 十字花科黑腐病菌分子遗传学研究概况  19-20
    1.2.1 十字花科黑腐病菌特征及其分类现状  19
    1.2.2 Xcc遗传学研究概况  19-20
  1.3 hrp基因概述  20-23
    1.3.1 hrp基因簇组成及功能  20-21
    1.3.2 hrp基因簇的调控机理  21-23
      1.3.2.1 hrp致病岛—效应物蛋白运输的遗传学基础  21-22
      1.3.2.2 hrp基因的表达  22-23
  1.4 T3SS效应物概述  23-32
    1.4.1 效应物的特征  23-25
      1.4.1.1 T3SS的特征  23-25
      1.4.1.2 效应物的特征  25
    1.4.3 效应物的研究概况  25-29
    1.4.4 全基因组鉴定效应物系统研究方法概况  29-31
    1.4.5 avr基因的研究概况  31-32
  1.5 hpa基因研究概述  32-35
    1.5.1 hpa基因在Xcc 8004 hrp致病岛的基本分布及hpa基因研究概况  32-33
    1.5.2 hpa基因研究概况  33-35
  1.6 本研究的目的和意义  35-36
    1.6.1 目的与内容  35
    1.6.2 研究意义  35-36
第二章 材料与方法  36-59
  2.1 菌株和质粒  36-40
  2.2 培养基及培养条件  40-41
    2.2.1 大肠杆菌(E.coli)  40
    2.2.2 黄单胞菌(Xcc)  40-41
  2.3 菌种保藏  41
  2.4 常用抗生素  41
  2.5 常用溶液、缓冲液  41-42
  2.6 细菌核酸的制备  42-44
    2.6.1 细菌总DNA的提取  42
    2.6.2 质粒的提取(碱裂解法)  42-43
    2.6.3 细菌总RNA的提取  43-44
    2.6.4 cDNA的合成  44
  2.7 细菌总蛋白的制备  44-45
  2.8 凝胶电泳  45-46
  2.9 Western印迹  46-47
  2.10 感受态细胞的制备和转化  47-49
    2.10.1 电击法转化大肠杆菌  47-48
    2.10.2 氯化钙法转化大肠杆菌  48-49
  2.11 DNA操作  49
    2.11.1 DNA片段的回收  49
    2.11.2 DNA的酶切和连接  49
  2.12 PCR扩增DNA片段  49-52
    2.12.1 PCR引物的设计  49-50
    2.12.2 PCR反应  50-52
    2.12.3 反转录PCR(RT-PCR)  52
  2.13 DNA测序  52-53
  2.14 三亲本接合  53
  2.15 突变体营养缺陷型检测  53
  2.16 胞外酶的检测  53-54
    2.16.1 胞外蛋白酶的检测  53-54
    2.16.2 胞外淀粉酶的检测  54
    2.16.3 胞外纤维素酶的检测  54
  2.17 胞外多糖的检测  54
  2.18 植物试验  54-56
    2.18.1 致病性试验  54-55
    2.18.2 过敏反应(HR)试验  55-56
      2.18.2.1 十字花科黑腐病菌过敏性反应检测  55-56
  2.19 细菌在培养基中的生长繁殖  56
  2.20 细菌在寄主中的生长繁殖  56-57
  2.21 整合突变体的构建  57
    2.21.1 整合突变体的构建  57
    2.21.2 整合突变体的验证  57
  2.22 突变体的反式功能互补  57
  2.23 候选效应物基因的表达构建  57-58
  2.24 目的基因启动子报道基因的构建  58
  2.25 候选基因的转运检测构建  58
  2.26 β-葡糖醛酸酶(GUS)活性平板检测  58-59
第三章 结果与分析  59-86
  3.1 报告质粒pLAG、pLJ-B、pJAG、pJJB的构建  59-66
    3.1.1 构建策略  59-60
    3.1.2 构建结果  60-62
      3.1.2.1 pLXG,pJXG的构建  60-61
      3.1.2.2 pLJB,pJJB,pLAG,pJAG的构建  61-62
    3.1.3 报告质粒的分子验证  62-65
    3.1.4 报告质粒效应物转运实验验证  65-66
  3.2 hpa基因功能的验证  66-86
    3.2.1 各hpa基因非极性整和突变体的构建和验证  67-69
      3.2.1.1 Xcc 8004各hpa基因在各病原菌间的分布(表3-1)  67
      3.2.1.2 Xcc 8004基因组上目标基因的整合突变体的构建  67
      3.2.1.3 3001NK的构建  67-68
      3.2.1.4 3014NK的验证  68
      3.2.1.5 3022NK的验证  68-69
    3.2.2 影响致病性或过敏反应的hpa基因互补菌株的构建  69-70
    3.2.3 各hpa基因突变体及hrpF突变体的致病性上株结果  70
    3.2.4 各hpa基因突变体及互补株的致病性上株结果  70-71
    3.2.5 各hpa基因整合突变体及互补株的HR上株结果  71-72
    3.2.6 各hpa基因整合突变体及互补株的表型检测  72-74
    3.2.7 各hpa基因信号区融合pL6gus,检测其是否有独立的启动子  74-77
    3.2.8 RT-PCR进一步检测hpa基因是否hrpG,hrpX调控及Xcc 8004 hrp基因簇在不同培养基中的表达差异情况  77-78
    3.2.9 各hpa基因自身是效应物或分子伴侣  78-81
    3.2.10 已知效应物及hrpF导入各非效应物突变体后的HR结果  81-86
第四章 讨论  86-101
  4.1 关于hpa基因  86-88
    4.1.1 关于hpa1基因  86
    4.1.2 关于hpa2基因  86-87
    4.1.3 关于hpaB基因  87
    4.1.4 关于hpaP基因  87
    4.1.5 关于XC3024基因  87
    4.1.6 关于hpaA基因  87-88
    4.1.7 关于hpa基因表达条件的讨论  88
  4.2 关于效应物转运和分泌的鉴定系统  88-101
致谢  101-102
攻读学位期间发表论文情况  102

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 细菌
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