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烟草打顶前后根尖组织SSH-cDNA文库的构建与分析

作　者: 马雷
导　师: 刘卫群
学　校: 河南农业大学
专　业: 烟草学
关键词: 烟草根尖 打顶 烟碱合成 抑制性消减杂交(SSH) 基因筛选
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


烟碱是烟草特有的生物碱,是烟草根系合成的次生代谢产物。烟碱自精氨酸或鸟氨酸途径形成吡咯环,自天冬氨酸途径形成嘧啶环,最终两环缩合形成烟碱的生物合成途径已被研究的相当清楚。打顶以后,烟株体内烟碱含量大量积累,然而对造成烟株体内烟碱含量升高的原因以及烟碱合成的调节机制并不清楚。生物碱生物合成的可诱导性特点表明,生物碱合成过程必定是信号转导的结果,尽管已有很多生物碱合成的关键基因被克隆,可被证实的参与生物碱合成的调控基因却很少。因此,用抑制性消减杂交的方法构建打顶前后的SSH-cDNA文库,筛选差异表达的基因,为揭示打顶对烟碱含量影响的分子基础具有很大的潜力。本研究以K326为材料进行打顶24h处理,打顶烟株为实验组(tester),不打顶烟株为对照组(driver)和不打顶烟株为实验组(tester),打顶烟株为对照组(driver),采用高灵敏度和高产出率的抑制差减杂交(SSH)技术构建烟草打顶前后根尖组织的SSH-cDNA文库,得到两个各含1000个克隆的正反向消减文库。通过筛选文库获得阳性克隆进行测序,利用生物信息学的方法进行分析,以期从基因组水平探讨烟碱生物合成的分子机理。主要研究结果为：(1)应用SSH技术成功构建了烟草打顶前后根尖组织的cDNA文库,克隆转化后经菌液PCR扩增分析发现cDNA插入片段大小主要分布在200—700bp之间,符合实验预期要求,为高效筛选差异表达基因奠定了基础。(2)利用反向Northern杂交对经菌落PCR初步验证得到的1300个克隆进行筛选,从中筛选到450个杂交信号差异明显的克隆,进行测序,将测序结果进行ESTs生物信息学分析,发现了一些参与调控烟碱合成的基因和转录因子,利用半定量RT-PCR验证3个EST序列(PMT、ODC、MADS-box)表达模式,发现在打顶后这3个EST序列的表达量增强。(3)将获得的非冗余EST序列进行功能注释,发现我们克隆的很多基因参与植物体内的代谢活动,如植物激素的合成、植物的次生代谢过程等,这些结果表明我们构建的文库良好,达到预期目标,并为进一步研究烟碱生物合成的分子机制奠定基础。

全文目录


致谢  4-7
摘要  7-8
1. 文献综述  8-12
  1.1 研究烟碱的意义  8
  1.2 烟碱的生物合成  8-9
  1.3 影响烟碱合成的因素  9-10
    1.3.1 氮素对烟碱合成的影响  9
    1.3.2 打顶对烟碱合成的影响  9-10
  1.4 基因差异表达的研究方法——抑制性消减杂交(SSH)技术  10-12
2. 引言  12-14
  2.1 研究的依据和目的  12-13
  2.2 研究的内容和技术路线  13-14
3. 材料与方法  14-26
  3.1 材料、试剂与仪器  14
    3.1.1 材料  14
    3.1.2 主要试剂  14
    3.1.3 主要仪器  14
  3.2 实验方法  14-26
    3.2.1 总RNA的提取  14-15
    3.2.2 mRNA的分离  15
    3.2.3 消减文库的构建  15-23
      3.2.3.1 cDNA第一条链的制备  15-16
      3.2.3.2 cDNA第二链的合成  16-17
      3.2.3.3 cDNA检测  17
      3.2.3.4 Rsa Ⅰ酶切  17-18
      3.2.3.5 接头连接  18-19
      3.2.3.6 连接效率检测  19-20
      3.2.3.7 第一次杂交  20
      3.2.3.8 第二次杂交  20-21
      3.2.3.9 选择性PCR扩增  21-22
      3.2.3.10 SSH第二次PCR产物的纯化  22-23
    3.2.4 消减cDNA文库的筛选(T/A克隆法)  23-24
      3.2.4.1 连接  23
      3.2.4.2 转化  23
      3.2.4.3 阳性克隆的挑选与扩增  23-24
    3.2.5 反向Northern杂交筛选  24-26
      3.2.5.1 杂交点阵膜的制备  24
      3.2.5.2 探针标记  24-25
      3.2.5.3 检测探针效率  25
      3.2.5.4 预杂交和杂交  25-26
      3.2.5.5 差异筛选  26
4. 结果与分析  26-37
  4.1 总RNA质量的检测  26
  4.2 cDNA检测以及RSA Ⅰ酶切  26-27
  4.3 连接效率检测  27-28
  4.4 SSH-cDNA文库的构建  28
  4.5 SSH-cDNA文库的筛选  28-31
    4.5.1 菌落PCR验证  28-29
    4.5.2 差异表达基因片段的反向Northern验证  29-31
      4.5.2.1 反向Northern杂交探针效率检测  29-30
      4.5.2.2 反向Northern验证  30-31
  4.6 ESTs生物信息学分析  31-36
    4.6.1 序列比对和预测结果  31-33
    4.6.2 ESTs序列功能注释(Functional Annotation)  33-36
  4.7 3个EST的RT-PCR分析  36-37
5. 结论与讨论  37-39
参考文献  39-45
ABSTRACT  45-46

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
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