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乙肝病毒基因经人精子传递新途径研究：胚胎细胞相关基因的筛选与功能分析

作　者: 刘冬玲
导　师: 黄天华
学　校: 汕头大学
专　业: 遗传学
关键词: HBV 人精子胚胎细胞芯片检测基因库基因筛选复制与表达
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 33次
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内容摘要

背景与目的乙型肝炎由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所致,是危害人类健康的全球性疾病。由于该病流行面广,危害性大,因此其传播途径,发病机制及治疗手段的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。已有研究证实,HBV基因能够整合到精子的染色体上,由精子导入受精卵的HBV基因能够在早期胚胎细胞中复制与表达。然而,HBV具有嗜肝性,着床前的胚胎细胞是未分化的全能细胞,它既非肝脏细胞,也非已分化的非肝脏细胞,HBV基因为何能在其中复制和表达?是否有宿主基因参与了上述生物学事件?这些问题的阐明,不仅在病毒传播的分子机制研究中具有重要的理论意义,还在阻断HBV基因传播、提高生育素质和防止肝癌发生方面具有广阔的应用前景。材料与方法材料:(1)人精子;(2)金黄地鼠去透明带卵母细胞;(3)项目组前期工作获得的、经大肠杆菌(E. coli DH5α)转染扩增的阳性重组质粒pGEM-T-X;(4)实验用试剂与培养基。方法:(1) PCR技术;(2)消减文库cDNA探针制备技术;(3)基因芯片技术;(4)测序技术;(5)生物信息学技术;(6)人精子与金黄地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精技术;(7) RT-PCR技术。结果1.消减文库经菌液PCR鉴定后,共得到152个阳性克隆,插入片段在500-1,500 bp,大部分集中在1,000 bp左右。2. PCR扩增重组质粒中插入的cDNA片段,经纯化后,收量均达到7μg,且无杂带干扰,每个样品重复3次,点制芯片。3.正、反向文库cDNA纯化后,质量检测合格,分别经PCR掺入Cy3和Cy5制备探针。4.芯片与探针杂交后进行扫描分析,挑选信号强度超过2倍平均信号强度的样品,共得到29个差异表达克隆。5.经测序和生物信息学分析,筛选出6个靶标基因。6.用人精子与金黄地鼠去透明带卵母细胞受精获得2-细胞胚胎。经RT-PCR,证实6个靶标基因在胚胎细胞中存在并能表达。结论在项目组成员前期工作的基础上,筛选出6个靶标宿主基因,它们是:①还原型辅酶(NADH);②蝶呤4α甲醇胺脱水酶(PCBD2);③绒毛膜生长激素(CSH);④真核翻译起始因子4(EIF4G2);⑤妊娠特异性β1糖蛋白4(PSG4)和⑥肌联蛋白(TTN)。它们有可能参与了HBV基因在早期胚胎细胞中的复制与表达。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
主要缩略语中英文对照表  11-13
前言  13-17
技术路线  17-19
材料与方法  19-29
  1 材料  19-20
    1.1 质粒  19
    1.2 实验动物及标本  19
      1.2.1 金黄地鼠  19
      1.2.2 精液标本  19
    1.3 主要试剂  19-20
    1.4 主要仪器  20
    1.5 其它材料  20
    1.6 主要溶液及培养基（配制见附录）  20
  2 方法  20-29
    2.1 菌液PCR鉴定消减文库  20-21
      2.1.1 实验样本  20
      2.1.2 引物的设计和合成  20
      2.1.3 步骤  20-21
    2.2 芯片的制备  21-23
      2.2.1 阳性重组质粒的提取  21-22
      2.2.2 PCR扩增重组质粒中插入的cDNA片段  22
      2.2.3 PCR产物的纯化  22-23
      2.2.4 点制芯片  23
    2.3 探针的制备  23-24
    2.4 芯片的杂交与洗片  24-25
    2.5 差异表达基因的鉴定  25
      2.5.1 图像的扫描与分析  25
      2.5.2 确定阳性克隆  25
      2.5.3 测序  25
    2.6 靶标基因的认定及其功能分析  25-26
    2.7 宿主细胞中靶标基因存在及表达的验证  26-29
      2.7.1 RT-PCR引物的设计及合成  26
      2.7.2 样本收集和实验动物处理  26-27
      2.7.3 RT-PCR检测  27-29
结果  29-37
  1. 菌液PCR鉴定结果  29-30
  2. 芯片的准备  30
  3. 探针检测结果  30-31
  4. 芯片检测结果  31-35
    4.1 芯片扫描结果  31-32
    4.2 Cy3 和Cy5 相关性分析  32
    4.3 阳性克隆的筛选  32-35
  5. 测序结果  35
  6. 靶基因的认定及其功能分析  35
  7. 宿主细胞中靶标基因存在及表达的验证  35-37
    7.1 RT-PCR引物的设计及合成  35-36
    7.2 宿主靶标基因在胚胎细胞中存在与表达的证实  36-37
讨论  37-45
全文小结  45-46
特色与创新  46-47
参考文献  47-54
附录  54-90
致谢  90-91
综述  91-98
  参考文献  96-98
个人简历  98-99

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