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抗基孔肯亚病毒单克隆抗体人源化及真核细胞高效表达研究

作　者: 李建民
导　师: 王海涛；童贻刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 嵌合抗体哺乳动物细胞基因表达定点整合
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本研究选择在中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞中表达具有中和活性的抗基孔肯亚(chikungunya，Chik)病毒的嵌合抗体，以图为Chik病的治疗提供被动免疫制剂。为表达嵌合抗体，首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)VL和VH基因及人工gG1亚类的CH和CK基因，通过融合PCR构建了抗Chik病毒的完整人-鼠嵌合抗体基因。将人-鼠嵌合抗体基因克隆到表达载体的多克隆位点(mutiple cloning site，MCS)，构建了恒定区(constant region，C区)为cDNA序列的表达质粒。将构建的嵌合抗体表达质粒转染CHO／dhfr-细胞，经氨甲喋呤(methotrexate，MTX)加压筛选，获得最高表达量为2μg／ml的细胞株。对此细胞株扩大培养并纯化抗Chik病毒的嵌合抗体。纯化的嵌合抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD的带，在还原SDS-PAGE中表现为一条约50kD和一条约25kD的带；Western印迹结果显示，全分子蛋白和重链(heavy chain，H链)分子均可与羊抗人IgG Fc发生特异性免疫反应；全分子蛋白和轻链(light chain，L链)分子均可与羊抗人Kappa发生特异性免疫反应。用间接免疫荧光实验(indirect immunofloresence assay，IFA)检测显示，纯化的嵌合抗体与Chik病毒抗原发生强反应，说明表达的嵌合抗体保留了亲本鼠源McAb的抗原结合活性。用不同浓度的纯化嵌合抗体和鼠源McAb进行微量细胞中和实验，结果25μg／ml的嵌合抗体和15μg／ml的鼠源McAb可以保护细胞不出现病变，说明嵌合抗体具有与鼠源McAb相同的生物学活性。为了提高嵌合抗体的表达量，我们尝试用Flp-InTM系统表达嵌合抗体，获得表达量为1μg／ml的稳定表达细胞株。遗憾的是此系统不能进行基因扩增，基于此，我们构建了在染色体的转录活性位点整合了FRT序列的CHO／dhfr-细胞株，命名为CHO／dhfr-FRT+。在此细胞株中，表达了抗chik病毒的嵌合抗体，通过MTX加压筛选，获得表达量为5μg／ml的稳定表达细胞株，是Flp-InTM表达系统的5倍，是CHO／dhfr-表达系统的2． 5倍。有报道称，Ck基因组序列能改善抗体在CHO细胞中的表达。但未见CH基因组序列是否较cDNA序列表达量高的报道。因此克隆人抗体分子IgG1亚类CH区基因组序列并构建了C区为基因组序列的双基因表达质粒，用F1p-InTM系统研究了C区为cDNA序列和基因组序列对抗体表达量的差异，结果显示CH区使用cDNA序列是基因组序列抗体表达量的3倍。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
引言  6-10
第一部分抗基孔肯亚(Chik)病毒人-鼠嵌合抗体基因的克隆及序列分析  10-21
第二部分抗Chik病毒嵌合抗体表达质粒的构建  21-26
第三部分抗Chik病毒嵌合抗体的表达、纯化和活性研究  26-38
第四部分用定点整合系统表达抗Chik病毒嵌合抗体的研究  38-48
第五部分用Flp-In~(TM)系统研究抗体基因结构对表达量的影响  48-56
结论  56-57
参考文献  57-61
附录一主要溶液的配制  61-65
附录二主要缩略语表  65-68
论著一抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达  68-73
综述一细胞内抗体应用的研究进展  73-77
综述二嵌合抗体及其在哺乳动物细胞中的表达研究进展  77-84
个人简历  84-85
致谢  85

抗基孔肯亚病毒单克隆抗体人源化及真核细胞高效表达研究

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