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钩端螺旋体致病相关基因的鉴定与功能研究

作　者: 张怡轩
导　师: 吴春福；赵国屏
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药学
关键词: 钩端螺旋体生物信息学致病性溶血素血小板激活因子乙酰化酶毒素-抗毒素系统
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本实验是在中国人类基因组南方研究中心2001年10月份完成我国境内问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株#56601(Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar lai type strain #56601)(强毒株)全基因组测序的基础上开展的。在部分参与基因注释过程中，发现一系列和致病相关的基因，如黏附和侵袭相关基因、鞭毛基因、运动／趋化相关基因、LPS合成相关基因、信号传导基因、与溶血、贫血、黄疸相关的溶血素基因、与出血相关基因、调节菌体生长状态的凋亡基因等等。致病性钩端螺旋体全基因组所揭示的独特的生理学和病理学特征发表在2003年4月24日出版的Nature杂志，其中与溶血、出血、菌体凋亡相关的部分基因功能的研究结果来自本实验。钩端螺旋体(Leptospira)是一种呈细长丝状、圆柱形、螺旋盘绕规则而致密的螺旋体，它需氧、运动活泼，是一种既能在体内生长、又能在体外培养的微生物，在世界范围引起人兽共患病—钩端螺旋体病。其体外生长受到很多因素的影响。较适宜的培养基为EMJH和Korthof培养基，但生长缓慢(需40～50个小时达到对数期)，菌浓低。幼龄豚鼠感染实验证明：体外培养的有毒株仍然具有强致病性，无毒株无致病力，两者在毒力方面有显著差别。利用生物信息学手段首次预测钩端螺旋体染色体共编码了十个溶血素基因，其中九个未知，分为两大类，即鞘磷脂酶类(LA1027，LA1029，LA3050，LA4004)和非鞘磷脂酶类(LA0327，LA0378，LA1650，LA3937，LA0150)。在原核系统中克隆、表达并纯化了其中八个溶血素基因，血平板“热-冷孵育”法鉴定了这些蛋白的溶血功能。薄层层析法和高效液相色谱法进一步鉴定LA1027，LA1029，LA3050和LA4004的鞘磷脂酶活性。如此众多的溶血素基因同时编码于同一个染色体上，这在微生物界是首次发现。 RT-PCR实验证明溶血素基因在钩端螺旋体中都转录；Western-blot实验证明在EMJH环境下，大多数溶血素基因都表达(LA1027不表达，LA3050只在有毒株中表达)，而且和毒性无关；ELISA实验证实多数溶血素蛋白均能被分泌到菌体外，分泌量和毒力相关(其中LA1027和LA0378几乎为零)。钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素LA1029和非鞘磷脂酶类溶血素LA3937均对细胞有显著的毒性作用，致使细胞绒毛消失，细胞膜破裂或完全消失，胞质外漏，胞桨染色变浅，细胞器肿大、外溢、丢失，细胞核出现空泡，细胞染色质凝集，甚至核膜边缘不整齐，有破裂，细胞坏死现象严重。大量的细胞碎片黏附在为数不多的完整细胞表面。部分肝细胞出现典型的细胞凋亡现象，如线粒体肿大，细沈阳药科大学博仁学位论文摘要胞核边聚、浓缩、有多个核结构，裂解为核小体。流式细胞术检测发现LA 1 029能诱发14.73%一57.92%的肝细胞发生凋亡，但是不能诱发肾细胞293凋亡;LA3937能引发肾细胞周期改变。人cDNA array结果表明LA1029能显著改变肝细胞的表达谱，其中90个基因的表达发生显著变化，上调基因10个，下调基因80个，这些基因主要分布在与肿瘤发生、信号转导、细胞凋亡、细胞周期、代谢、蛋白质合成等方面，说明 LA 1 029能引起组织细胞的多种病理改变。此外，溶血素LA 1 029能刺激细胞分泌炎症介导因子IL一lp和IL一6。说明钩端螺旋体溶血素即能引起严重的细胞坏死，也能引起细胞凋亡，和钩体病患者的组织器官炎性反应、发热、功能障碍、衰竭有直接关系。钩端螺旋体染色体还编码一套可能和出血病症相关的基因，包括1个溶菌酶基因(acm)，1个胶原酶基因(colA)，17个Yer6’inia YopM蛋白基因(，勿，卿、l个血小板激活因子乙酞化酶基因切旷ah)、2个类似于von Willebrand faetorAdomain的基因(vwA了，v砂月2)。这些基因除了vwAZ之外均转录，由此推测构建一副出血模型图。以牛脑胞内PAF一AHI型蛋白Y亚基1认AB(PDB数据库编号)为模件，计算机模拟出钩端螺旋体队F一AH(LAZ 144)蛋白的立体结构，发现它们极其相似，酶催化位点(ser“’一Hisz08一Asp20，)保守。检测菌体和培养上清液中队F一AH酶活性，发现其不分泌到细胞外，可能是一种胞内酶。Westom一blot显示队F一AH表达量与毒性相关。克隆、表达并纯化重组蛋白PAF一AH，发现其米氏常数Km同正常人血清Km，血小板凝集实验进一步证明重组PAF一AH具有阻止血小板聚集的生物学活性。比较血清队F一AH酶活性，发现黄疽出血群患者酶活性显著高于正常人和其他型钩体病患者，推测这可能是由于毒力株黄疽出血群钩体释放了大量PAF一AH到人体血液系统中，灭活宿主体内血小板激活因子(PAF)的生理活性，使血小板不能勤附、聚集到毛细血管微小受损处，不能分泌众多凝血因子，从而妨碍宿主的止血及凝血，导致大出血症状，是钩端螺旋体出血症状的重要致病因子之一。比较基因组分析，发现钩端螺旋体编码了一对紧密联系的基因座vopBc loci，该基因与其他微生物中的同类基因在氨基酸序列和操纵子结构上相似。在大肠杆菌表达系统中单独表达v即刀、vopc基因，发现vopC基因产物抑制菌体的生长，同时表达vaPB和vaPc基因时，菌体生长正常。这种现象与现

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摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-18
英文缩写  18-20
第一章钩端螺旋体溶血素基因功能的研究  20-138
  第一节钩端螺旋体体外培养和溶血活性的检测  20-31
    序  20-21
    1 实验材料  21-22
    2 实验方法  22-24
    3 实验结果  24-29
      3.1 钩端螺旋体体外培养  24-27
        3.1.1 钩端螺旋体生长状况考察  24-25
        3.1.2 透射电镜下钩端螺旋体形态  25
        3.1.3 钩端螺旋体在EMJH或Korthof液体培养基中生长曲线的测定  25-26
        3.1.4 钩端螺旋体毒力的考察  26-27
      3.2 钩端螺旋体菌体超声上清液及培养液蛋白浓度测定  27-28
      3.3 钩端螺旋体溶血活性的检测  28-29
    4 小结  29
    5 讨论  29-31
  第二节钩端螺旋体溶血素基因的注释、克隆表达和活性检验  31-63
    序  31-32
    1 实验材料  32-35
    2 实验方法  35-41
    3 实验结果  41-61
      3.1 钩端螺旋体溶血素基因的注释与分类  41-53
        3.1.1 钩端螺旋体溶血素基因特征  41-42
        3.1.2 钩端螺旋体溶血素基因分类  42-53
      3.2 钩端螺旋体溶血素基因的克隆与表达  53
      3.3 重组溶血素蛋白的诱导表达  53-55
      3.4 重组溶血素蛋白溶血活性检测  55-56
      3.5 溶血素鞘磷脂酶活性的检测  56-58
        3.5.1 薄层层析法检测  56-57
        3.5.2 高效液相色谱法检测  57-58
      3.6 鞘磷脂酶类溶血素LA1029的底物特异性考察  58-59
      3.7 各种因子对鞘磷脂酶LA1029的酶活性影响  59-60
      3.8 钩端螺旋体溶血素基因的提交  60-61
    4 小结  61
    5 讨论  61-63
  第三节钩端螺旋体溶血素基因的转录和表达  63-80
    序  63
    1 实验材料  63
    2 实验方法  63-68
    3 实验结果  68-79
      3.1 钩端螺旋体总RNA的抽提  68-69
      3.2 钩端螺旋体溶血素基因的转录情况考察  69-71
      3.3 重组溶血素蛋白多克隆抗体制备及滴度测定  71-73
        3.3.1 重组溶血素蛋白的变性纯化  71-72
        3.3.2 溶血素多克隆抗体滴度测定  72-73
      3.4 Western-blot检测钩端螺旋体溶血素的表达  73-76
      3.5 分泌型钩端螺旋体溶血素的检测  76-79
    4 小结  79
    5 讨论  79-80
  第四节钩端螺旋体溶血素对宿主细胞结构和功能的影响  80-111
    序  80
    1 实验材料  80-83
    2 实验方法  83-89
    3 实验结果  89-110
      3.1 倒置显微镜观察溶血素对细胞的作用及溶血素抗体的保护作用  89-92
        3.1.1 小鼠淋巴细胞形态的变化  89-90
        3.1.2 小鼠巨噬细胞形态的变化  90-91
        3.1.3 人传代细胞形态的变化  91-92
      3.2 透射电镜观察溶血素对细胞的作用  92-98
        3.2.1 溶血素作用绵羊红细胞后形态的变化  93-94
        3.2.2 溶血素作用人组织细胞后形态的变化  94-98
      3.3 扫描电镜观察溶血素对细胞的作用  98-101
        3.3.1 小鼠巨噬细胞形态的变化  99-100
        3.3.2 人肾细胞293形态的变化  100-101
      3.4 溶血素对细胞凋亡的影响  101-106
        3.4.1 溶血素LA1029引起的细胞凋亡  102-104
        3.4.2 溶血素LA3937引起的细胞凋亡  104-106
      3.5 溶血素作用BALB／C小鼠免疫细胞后细胞因子的诱生  106-110
    4 小结  110
    5 讨论  110-111
  第五节基因芯片检测溶血素引起的细胞表达谱改变  111-138
    序  111-112
    1 实验材料与方法  112-115
    2 实验结果  115-137
      2.1 基因芯片质控  115-119
        2.1.1 总RNA抽提质控  115-116
        2.1.2 扫描信号质控  116-119
      2.2 基因芯片检测结果  119-120
        2.2.1 双色荧光叠加图  119-120
        2.2.2 杂交信号强度散点图  120
      2.3 差异表达基因的分类  120-121
      2.4 差异表达基因的说明  121-137
    3 小结与讨论  137-138
第二章钩端螺旋体血小板激活因子乙酰化酶基因的功能研究  138-165
  序  138-139
  1 实验材料  139-140
  2 实验方法  140-143
  3 实验结果  143-163
    3.1 钩端螺旋体中与出血相关基因的预测  143-145
    3.2 血小板激活因子乙酰水解酶基因(paf-ah)的注释  145-149
      3.2.1 钩端螺旋体PAF-AH一、二级结构相似性分析  146-147
      3.2.2 钩端螺旋体PAF-AH三级结构模拟  147
      3.2.3 钩端螺旋体PAF-AH穿膜结构与信号肽预测  147-149
    3.3 钩端螺旋体病出血模型  149-152
    3.4 钩端螺旋体中与出血相关基因转录的考察  152-154
    3.5 paf-ah基因的克隆、表达及该蛋白在钩体菌中表达情况的考察  154-155
    3.6 血小板激活因子乙酰化酶米氏常数(Km)测定  155-158
    3.7 重组PAF-AH蛋白对正常人血小板聚集功能的影响  158
    3.8 不同培养条件不同毒力株的PAF-AH酶活力比较  158-160
    3.9 正常人与钩体病患者血清中PAF-AH酶活性的比较  160-163
  4 小结  163
  6 讨论  163-165
第三章钩端螺旋体凋亡基因的鉴定  165-188
  序  165-167
  1 实验材料  167-168
  2 实验方法  168-171
  3 实验结果  171-186
    3.1 钩端螺旋体凋亡基因的分布与结构特征  171-172
    3.2 VapB与VapC基因的注释与结构分析  172-173
    3.3 VapB与VapC基因的注释与结构分析  173-174
    3.4 VapC基因对大肠杆菌生长的抑制作用以及VapB基因的去抑制作用  174-175
    3.5 vapBC locus在钩端螺旋体不同菌株中的保守性考察  175-176
    3.6 vapBC系统对质粒稳定性的作用  176-177
    3.7 凋亡基因的表达与培养时间的关系  177
    3.8 染色体编码的TA凋亡基因的进化分析  177-186
  4 小结  186-187
  5 讨论  187-188
结论  188-189
参考文献  189-203
附图  203-215
致谢  215-216
发表文章  216

钩端螺旋体致病相关基因的鉴定与功能研究

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