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上海近郊某地区犬Torque Teno virus感染率调查及全基因组序列分析

作　者: 叶剑波
导　师: 华修国
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬TTV 基因组分析蛋白质结构功能预测进化分析生物信息学
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

2010年3月～5月从上海近郊地区采集199份不同品种的家养犬血清,根据GenBank上犬TTV病毒全基因组序列(Cf-TTV10,登录号:AB076002)设计PCR嵌套引物检测犬血清中TTV病毒,并进行流行病学统计分析。结果表明犬TTV的阳性率为14.6%(29/199),其中H地区的感染率较高(7/16),与其它地区(22/183)犬TTV的感染率存在极显著差异(p<0.01);不同品种之间,中型犬(牧羊犬、猎犬等)较小型犬(博美、贵宾等观赏犬)更易感犬TTV病毒(p<0.1),其中中型犬中萨摩耶(4/8)与边境牧羊犬(2/3)的感染率较高,与平均感染率之间存在极显著差异(p<0.01),说明牧羊犬类较其它品种的犬更易感TTV;雌性犬的感染率为20.1%,雄性犬感染率为11.0%,不同性别感染率间存在显著差异(p = 0.059)。选取病毒载量最高的一份血清,设计两套反式(4对)引物进行犬TTV全基因组序列的扩增,阳性克隆株命名为Sh-TTV203,并进行生物信息学分析。参考已知的犬TTV全基因组,分析本研究中犬TTV基因组的ORF分布、启动子、CpG岛、polyA等功能结构,确定包含高变区的ORF I的具体位置,并对ORF I蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽等方面进行分析.通过同源建模的方式预测ORF I蛋白的三维结构,进而分析ORF I蛋白的基序(motif)、结构域和抗原表位。研究发现ORF I蛋白为犬TTV的外壳蛋白,该蛋白可能与病毒毒力、病毒融合宿主细胞膜有关,该蛋白归属于Viral_ssRNA_CP蛋白家族。其中抗原表位的预测为犬TTV免疫机制研究提供理论参考。根据GenBank数据库中人TTV、非人灵长类TTV、海龟Tomovirus、树鼯TTV、猪TTV、犬TTV和猫TTV的全基因组序列,与本研究获得的犬TTV进行ClustalX做多序列比对,使用Phylip进化分析软件包,采用距离法、最大简约法(maximum parsimony,MP)和最大似然法(maximum likelihood,ML)对序列进行遗传进化分析。结果表明犬TTV与猪TTV1型亲缘关系最近,而猪TTV2型与其1型差别较大,位于树鼯TTV和獠狨、夜猴之间,说明可能存在两个猪TTV种群的平行进化,或是跨种间传播。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩写和中英文对照  8-14
第一章文献综述  14-30
  1 发展简史  14-15
  2 TTV 作为一种新型肝炎病毒的发现  15-19
    2.1 历史  15-16
    2.2 理化性质  16-17
    2.3 单链环状DNA 病毒  17-18
    2.4 TTV 的变异度  18-19
  3 TTV 的检测方法  19-20
  4 TTV 和它的潜在致病性  20-22
    4.1 肝脏疾病  20-21
    4.2 肺部疾病  21
    4.3 血液疾病  21
    4.4 先天性肌炎  21
    4.5 免疫抑制  21-22
    4.6 系统性红斑狼疮  22
  5 动物TTV  22-24
    5.1 非人灵长类的TTV  22-23
    5.2 其他动物的TTV  23-24
    5.3 犬TTV  24
  6 TTV 的靶细胞  24-26
  7 基因结构与功能  26-28
    7.1 TTV 基因组的多样化  26
    7.2 剪接mRNA  26-27
    7.3 转录调控  27
    7.4 TTV 和CAV 的蛋白  27-28
  8 研究目的与意义  28-30
第二章上海近郊地区犬TTV 流行病学调查  30-40
  1 材料  30-32
    1.1 实验试剂与仪器  30-31
    1.2 样品  31-32
  2 方法  32-35
    2.1 样品处理  32-33
    2.2 血清样品中总DNA 的提取  33
    2.3 巢式PCR 扩增  33-34
    2.4 电泳  34
    2.5 PCR 产物的回收纯化  34-35
    2.6 回收产物与pMD18-T 载体连接反应  35
    2.7 转化及测序  35
    2.8 数据分析  35
  3 结果与讨论  35-38
    3.1 样品中犬TTV DNA 检测  35-36
    3.2 进化分析  36-37
    3.3 品种与感染率的关系  37-38
    3.4 地区与感染率的关系  38
    3.5 性别与感染率的关系  38
  4 小结  38-40
第三章 Sh-TTV203 株全长扩增与基因组序列分析  40-57
  1 Sh-TTV203 全序列测定  40-43
    1.1 Sh-TTV203 全长扩增  40-41
    1.2 电泳  41
    1.3 回收产物与pMD 18-T 载体连接反应  41-42
    1.4 转化及测序  42
    1.5 结果与讨论  42-43
  2 Sh-TTV203 基因组分析  43-56
    2.1 利用ORF Finder 预测ORF  44-47
    2.2 利用getorf 预测ORF  47-49
    2.3 利用glimmer3 预测基因  49
    2.4 利用GeneMark 预测潜在基因  49-50
    2.5 利用Proscan 预测启动子  50-53
    2.6 利用CpGPlot/CpGReport/Isochore 预测CpG 岛  53-56
    2.7 利用POLYAH 预测3’UTR 区  56
  3 小结  56-57
第四章 Sh-TTV203 ORF I 蛋白分析与高级结构预测  57-79
  1 蛋白质基本性质分析  57-66
    1.1 利用ProtParam 分析ORF I 蛋白理化性质  57-59
    1.2 利用ProtScale 分析ORF I 蛋白的疏水性  59
    1.3 利用TMHMM 分析ORF I 蛋白的跨膜区  59-60
    1.4 利用SignalP 3.0 分析ORF I 蛋白的信号肽  60-62
    1.5 利用COILS 分析ORF I 蛋白的coil  62-64
    1.6 利用TargetP 分析ORF I 蛋白的亚细胞定位  64-66
  2 motif、结构域与抗原表位分析  66-73
    2.1 分析ORF I 的motif  66-68
    2.2 利用SMART 分析ORF I 蛋白的结构域与家族  68-69
    2.3 抗原表位预测分析  69-73
  3 高级结构预测  73-78
    3.1 利用SSPro 分析ORF I 蛋白的二级结构  74-76
    3.2 预测ORF I 蛋白的三级结构  76-78
  4 小结  78-79
第五章 TTV 的进化分析  79-86
  1 使用距离法（NJ）重建系统发生树  79-81
  2 使用最大简约法（MP）重建系统发生树  81-83
  3 使用最大似然法（ML）重建系统发生树  83-85
  4 小结  85-86
总结  86-88
参考文献  88-97
附录1 在线工具  97-98
致谢  98-99
攻读硕士期间科研成果  99
  一发表论文  99
  二参加课题  99

上海近郊某地区犬Torque Teno virus感染率调查及全基因组序列分析

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