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新型抗体HLA-肽多聚体的制备及其对特异性CTLs的检测和诱导的研究

作　者: 孟晓静
导　师: 王小宁
学　校: 中国人民解放军第一军医大学
专　业: 分子免疫学
关键词: 抗体HLA-肽多聚体 MHC-肽四聚体 卵黄抗体 单克隆抗体 细胞毒性T淋巴细胞 流式细胞仪
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lyphocyte，CTL或Tc）在T细胞免疫应答中发挥重要作用，CTLs通过其细胞表面的特异性TCR与抗原提呈细胞上的MHC—Ⅰ类分子-抗原表位复合体结合，在第二信号的共刺激作用的协助下，特异性CTLs被诱导活化和增殖，产生特异性杀伤效应；这是机体有效控制各种感染、抗肿瘤及抗移植物的重要途径之一。长久以来，刺激特异性CTLs活化和增殖以及检测特异性CTLs的频数一直是细胞免疫研究的热点，然而体外研究CTLs的活性和功能存在许多困难如：抗原特异性CTLs的体外培养比较困难，扩增过程带来大量非抗原表位特异性T细胞，很难保证T细胞的抗原特异性，此外缺乏精确分析抗原表位特异性T细胞的频数及快速分离扩增这类细胞的技术。特别是对体内反应的T细胞克隆的频数和性质分析起来更为困难。以往的分析方法，如51Cr释放法、细胞因子分泌细胞的记数法，需体外培养，周期长，特异性差；近年来可溶性MHC-肽四聚体法成为新兴的研究方法，可用于分析和分离各种抗原特异性CTLs的表型，也可以用来研究抗原特异性CTLs反应，为进行与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、特异、敏感的检测手段。目前美国已开发出多种特异性MHC-肽四聚体，已被用于研究病毒性感染及肿瘤等多种疾病及其疫苗的效果评价，如HIV、EBV、CMV、黑色素瘤、宫颈癌等的研究。然而，MHC-肽四聚体制作过程中存在着复性率低、步骤繁琐等不足，而且从国外进口，价格昂贵，为解决这些问题，我们首次构建了新型抗体HLA-肽多聚体，进行了特异性表位CTL的刺激活化和检测方法的研究，并且首次固定抗体多聚体，筛选特异性T细胞，为建立新的特异性CTL的活化方法及筛选技术平台奠定了基础。 首先，我们将HLA-A*0201重链和轻链重组蛋白进行表达、发酵和纯化，HC和β2m重组蛋白的分子量约为32KD和13KD，表达水平分别为菌体总蛋白的43％和47％，经专利技术处理包涵体后，纯度得以大大提高，用Superdex 75凝胶过滤纯化后，HC的纯度达到95％，可用作抗原进行多克隆抗体和单克隆抗体的制备。 第二，以纯化的HLA一A*0 201重链重组蛋白免疫产蛋种鸡，三次免疫后卵黄抗体的滴度达到1:10“，经水稀释法纯化后，其纯度达到88%，其蛋白质含量为9.77mg/ml卵黄，用细胞一ELIsA法鉴定，可与HLA一A*0201阳性的Caski细胞特异性结合。说明卵黄抗体可与天然结构的HLA一A*0201结合，可用于下一步的抗体多聚体的制备。 第三，用纯化的HLA一A*0 201重链重组蛋白免疫BALB/c小鼠，经3次细胞融合，平均融合率为98%，阳性率为85%，选择6个克隆株连续3次克隆化阳性率达100%，得到三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞IAg、2H9和3C5，其中3C5属IgGI亚型，IAg和2H9属IgGZa亚型。以纯化的HC重组蛋白为抗原，三株单抗培养上清的ELISA效价为1:128一1:512，腹水效价为1:12800一1:25600。间接免疫荧光法显示，3株单抗均与HLA一A*0 201-的NS一1细胞没有反应，其中2H9株与HLA一A*0 201十的Caski细胞结合，而IA9和3C5无反应。说明2H9株的单克隆抗体可与天然结构的HLA一A*0 201结合，可用于下一步的抗体多聚体的制备。 第四，通过特异性肤段（流感病毒GILGFVFTL、巨细胞病毒NLVPMVATV）与HLA一A*0201重链和轻链重组蛋白的共同复性，得到HLA一AZ一肤组装复合体，两种HLA一AZ一肤组装复合体均可与W6/32单抗呈阳性反应，表明HLA一AZ一肤组装复合体与天然结构是一致的，HLA一AZ一肤组装复合体分别与HC卵黄抗体和单克隆抗体共孵育后，做非还原SDS一PAGE电泳，均显示有多聚体形成。说明成功构建了卵黄抗体和单克隆抗体HLA一肤多聚体。 第五，用CMV特异性单克隆抗体HLA一肤多聚体与外周血单核细胞（PBMC）反应，间接荧光标记后流式细胞仪检测CMV特异性CTLs的频数，结果表明单克隆抗体HLA一肤多聚体间接荧光法与C柳特异性MHC一肤四聚体检测无显著差异。说明新型抗体HLA一肤多聚体可用于特异性CTLs的检测。为进一步研究抗体HLA-肤多聚体对单表位特异性CTLs的作用，我们将CMV特异性卵黄抗体HLA一肤多聚体或单克隆抗体HLA一肤多聚体与PBMC共同培养后，发现两者刺激PBMC后CMV特异性CTLS均有增加。用卵黄抗体HLA-肤多聚体或单克隆抗体HLA一肤多聚体包板后与PBMC共孵育，吸附在板上的PBMC在抗CD3单抗的作用下继续培养，均发现PBMC中CMV特异性表位CTLs有显著增加。说明抗体HLA一肤多聚体不仅可结合特异性CTLs，而且能有效刺激抗原表位特异性CTLs的增殖，这将对特异性CTLS的活化机制和筛选方法研究具有重要的理论意义和应用价值。 综上所述，我们将HLA一A*0201重链和轻链重组蛋白表达、发酵和纯化，用纯化的重链重组蛋白作为抗原，制备卵黄抗体和单克隆抗体，同时制备CMV特异性表位的HLA一A*0201一肤组装复合体，与卵黄抗体和单克隆抗体合成了新型抗体HLA一肤多聚体，进行了CMv特异性表位的CTLs的检测，为研究各种感染和肿瘤的发生、发展和预后等过程中的细胞免疫机制，以及T细胞疫苗的评价打下坚实的基础。另外，我们用构建的抗体HLA一肤多

全文目录


英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-17
技术路线  17-18
第一部分 HLA-A* 0201-肽组装复合体的制备及鉴定  18-27
  摘要  18
  引言  18-19
  材料与方法  19-22
  结果  22-24
  讨论  24-26
  小结  26-27
第二部分 HLA-A* 0201的重链多克隆抗体及单克隆抗体的制备及鉴定  27-39
  摘要  27
  引言  27-28
  材料与方法  28-32
  结果  32-36
  讨论  36-38
  小结  38-39
第三部分 抗体HLA-A* 0201-肽多聚体的制备及对特异性CTL的诱导和检测  39-52
  摘要  39
  引言  39-40
  材料与方法  40-42
  结果  42-47
  讨论  47-51
  小结  51-52
总结  52-53
参考文献  53-61
文献综述  61-76
  参考文献  70-76
致谢  76

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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