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表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用

作　者: 陈志琳
导　师: 崔治中；秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒 免疫保护作用 鸡痘病毒 基因重组 血清Ⅱ型 免疫接种 血清Ⅰ型 保护指数 免疫保护效力 基因工程疫苗
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


30年来抗马立克氏病(MD)疫苗有了很大的发展，抗MD疫苗有下列几种：①单价疫苗，包括血清Ⅲ(HVT)，血清Ⅱ型(SB-1)及致弱的血清Ⅰ型(CV1988)MDV疫苗。②多价苗，包括二价苗(血清Ⅰ型+血清Ⅱ型，血清Ⅰ型+血清Ⅲ型和血清Ⅱ型+血清Ⅲ型)及三价苗。伴随着抗MD疫苗的发展，马立克氏病病毒(MDV)本身也在不断突变、演化，毒力不断增强，常规的单价苗、多价苗已难以控制毒力不断增强的MDV，在过去的10年中，科学家们通过对MDV分子生物学的研究，力图研制出比现在常规疫苗效果更好、使用更方便的抗MD基因工程疫苗。MDV分子生物学的研究进展，MDV全基因组测序工作的完成，及MDV一些重要基因的鉴定、定位及结构与功能方面的研究成果，促进了马立克氏病基因工程疫苗的研制和开发。MDVgB糖蛋白是MDV主要保护性抗原，rFPV-gB及rHVT-gB已显示良好的保护性免疫，但仅一个靶抗原，其免疫保护性仍然有局限性，因此人们也在寻找除gB之外，其他与保护性有关的抗原成分作为基因工程目的基因，对疱疹病毒囊膜糖蛋白的研究发现，gD、gB、gI、gC、gE和gG具有免疫保护作用，而把多个靶抗原联合使用时，具有协同免疫保护作用。糖蛋白gI是疱疹病毒中重要的囊膜糖蛋白，它可与其他囊膜糖蛋白组成双价或多价疫苗，提高单一囊膜糖蛋白的免疫保护效力。此外，有研究报告表明gI的同源编码产物在细胞间传播、毒力介导、FC受体活性等方面都起一定的作用。以MDVgI作为靶抗原，开展保护性免疫研究，国内外未见报道。本研究以MDV gI为研究对象，以鸡痘病毒(FPV)中国株为载体，构建表达MDV gI基因的重组鸡痘病毒(rFPV)，在构建成功表达MDV gI的rFPV的基础上，进一步分析rFPV-gI扬州大学博士学位论文的稳定性及鸡对rFPv一gI的抗体反应性，然后研究它的免疫保护效力，为研制rFPV一MDv一gl基因工程疫苗，进一步开发多价MDV基因工程重组疫苗奠定基础。 根据MDV 648A株病毒基因组gl基因序列，我们设计了两个引物，用PCR扩增出MDVgl基因。通过琼脂糖凝胶电泳，获得一条1 060 bp DNA条带，与MDvgl基因的大小是一致。在此基础上，用Qiagen公司胶回收试剂盒来纯化PCR产物。用Smal及Xhol来酶切PCR产物。用Smal和Sall酶切鸡痘病毒转移质粒载体pFGI 175一1。连接，转化大肠杆菌DHS。，转化菌经筛选后，得到一个含gl基因的阳性克隆，进一步纯化此阳性克隆DNA。用全自动测序仪测定插入片段DNA序列，证明插入片段DNA序列与MDv·648A一gI序列完全一致。此含MDVgi基因的重组转移质粒命名为pFGgill75一1。通过脂质体方法，将pFGglll75一1转染已感染FPv野毒(wt)的鸡胚成纤维细胞(cEF)，孵育3天后，通过蓝斑筛选法，筛选纯化四次后得到纯化的:FPv，用PCR扩增rFPV DNA，证实此rFpV含MDV 91基因。用FPv(wt)及rFPv感染96孔板上CEF，用pBS洗涤，丙酮固定，然后加抗gI单克隆抗体37℃孵育30分钟，PBS充分洗涤后，与抗鼠IgG荧光标记抗体作用，结果显示，rFPv感染的cEF有很强的荧光，而FPv(wt)感染的CEF没有荧光。说明MDvgl得到表达，此表达MDVgl基因rFpV命名为rFpV一MDV 64891。 用rFpv一MDv64sgl感染eEF，传代20次后，此rFPv仍然能够在CEF上稳定复制。用lo4PFurFPv一MDv64sgl及FPv(wt)分别接种l日龄sFP鸡，饲养于带正压过滤空气隔离器中，接种前及接种后20天采血收集血清，用间接免疫荧光法(IFA)分析血清与感染MDv的cEF反应情况。结果表明接种FPv一MDv648gl后鸡血清中含有抗gI抗体。 用104或lo6PFurFPv一Mnv“591接种l日龄sPF鸡和蛋鸡，在接种后10天后用MDV RBIB攻毒，隔离饲养60天，在此期间，解剖死亡鸡，检查记录MD大体病变，饲养第60天扑杀存活鸡，统计记录MD大体病变。接种1了PFu rFPv的伊莎蛋鸡的保护指数为22.97，rFPv一gl免疫接种组MDv发病率及死亡率低于FPv(wt)接种组，但差异不显著。接种1护PFU rFPv的白来航蛋鸡的保护指数为27.40，rFpV一91免疫接种组MDv发病率显著低于FPv(讯)接种组(P<0.05)，陈志琳:表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用rFPv一gI免疫接种组MDv死亡率低于FPv(wt)接种组，但差异不显著。接种100PFu的sPF鸡保护指数为23.53，rFPv一gI免疫接种组MDv发病率及死亡率均显著低于FPV(wt)接种组(P<0.05)。 此结果表明表达MDVgl基因的rFPv有一定程度的抗超强毒株免疫保护力。本研究是国内外首次报导构建表达MDvgi基因重组FPv，首次证实rFPV一MDVgi具有一定程度的抗超强毒株免疫保护力。

全文目录


中文文摘  5-8
英文文摘  8-11
符号说明  11-13
综述一 马立克氏病毒蛋白及疫苗研究进展  13-42
  1 MDV蛋白  13-24
  2 抗MDV疫苗  24-30
  3 参考文献  30-42
综述二 疱疹病毒糖蛋白Ⅰ的研究进展  42-55
  1 gI基因及蛋白的结构  42
  2 FC受体活性  42-43
  3 gI在疱疹病毒囊膜形成中的作用  43-47
  4 gI在病毒传播及毒力介导中的作用  47-48
  5 gI在疫苗保护性免疫中的作用  48-49
  6 MDV gI的研究进展  49-50
  7 参考文献  50-55
第一章 表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的构建  55-76
  1 材料和方法  55-63
  2 结果  63-70
  3 讨论  70-72
  4 参考文献  72-76
第二章 表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性及稳定性  76-84
  1 材料和方法  76-78
  2 结果  78-79
  3 讨论  79-82
  4 参考文献  82-84
第三章 表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫保护作用  84-96
  1 材料和方法  84-86
  2 结果  86-87
  3 讨论  87-94
  4 参考文献  94-96
附录一 常用配方  96-98
附录二 原始基因测序图  98-103
致谢  103-104
攻读学位期间发表的学术论文目录  104

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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