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表达新城疫病毒F、HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验

作　者: 丁炜东
导　师: 刘秀梵；吴艳涛
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 重组鸡痘病毒遗传稳定性免疫保护效力
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 134次
引　用: 3次
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内容摘要

新城疫（ND）是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，其病原为新城疫病毒，是副粘病毒科腮腺炎病毒属的代表种，为一种单股负链RNA病毒，融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）是构成病毒囊膜表面突起的两种结构糖蛋白，在ND的感染过程中起着重要的作用。F蛋白参与病毒的穿透、融合和溶血等作用，HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性，在NDV侵染过程中起着识别细胞受体的作用。两者均是NDV的保护性抗原，具有良好的免疫原性。在鸡ND的防制中，我国目前仍采用疫苗接种为主的综合防制措施。但由于ND强毒污染严重等原因常引起免疫失败，使ND仍时有发生。本室利用基因工程方法构建的表达NDV F₄₈E₈株F、HN基因的重组鸡痘病毒疫苗，是构建新型疫苗来防制ND的一种新的尝试。本文对这两种疫苗的稳定性、免疫保护效力进行了系统的研究，为这两种疫苗的生产应用作了进一步的探索。在遗传稳定性试验中主要进行了连续传代的细胞病变产生速度，细胞病变的形态变化、基因表达的稳定性试验、外源病毒的检测、冻干苗的保存试验等。以这两种疫苗在鸡胚成纤维（CEF）单层细胞上连续传20代，其引起的细胞病变速度、细胞病变形态均未发生显著的变化，覆盖含X-Gal的琼脂后所有的空斑均为蓝斑；表达稳定性试验中以间接免疫荧光试验检测0、10、20代疫苗F、HN基因的表达，取0、10、20代重组病毒DNA为模板进行PCR扩增，可分别扩增出特异的1.7Kb、1.9Kb的外源基因片段，测序后与原代相比，F基因有5个核苷酸发生变化，但只有1个氨基酸发生变化，HN基因仅有2个核苷酸发生变化，氨基酸有1个发生变化；按照申报兽医新生物制品的要求对生产用疫苗种毒进行支原体和外源病毒的检测，结果表明，随机抽检的两批疫苗没有支原体和外源病毒的污染；取20代内种毒经500ml和3000ml转瓶及60mm平皿进行扩增，其产量均能达到兽用新制品的要求；取20代内种毒以不同的保护剂与疫苗按适当比例混合制成冻干疫苗，4℃保存，间隔一定时间抽检计数，结果显示，冻干后制品的效价稍高于冻干前制品的效价，而且在一扬州大学硕士学位论文定的保存期内，7种保护剂的保护效力差异不显著。为了评价这两种疫苗的免疫保护效力，我们在SPF鸡、普通肉鸡和蛋鸡上进行了免疫效力试验。应用这两种疫苗分别以1扩、10‘、1护、IO6PFU/羽颈部皮下接种1日龄sPF鸡群，于7、10、14、21日龄采血分离血清，测H1价。表达HN的重组鸡痘病毒免疫的鸡于10日龄时可以测出HI价，至21日龄时可达5.7吨2，略低于常规疫苗。对于表达F的重组鸡痘病毒用间接EL工SA和竞争ELISA方法检测抗体，结果表明这两种方法均能较好地检测出F抗体的消长规律。21日龄以IOSELD，的新城疫病毒NDVF4正，攻击，连续观察10天，结果10aPFU/羽的接种剂量就足以保护SPF鸡免受NDV强毒的攻击，与ND油苗、IV系苗相当。用肉鸡和蛋鸡进行的免疫效力试验，肉鸡在1日龄时进行免疫，21日龄时攻毒。蛋鸡在母源抗体下降到2吨2以下时免疫，.21天后以阮E，NDV强毒攻击，其保护率不高，表达HN基因的重组鸡痘病毒的保护效力略高于表达F基因的重组鸡痘病毒。初步分析其原因，可能是重组病毒疫苗的免疫效力受NDV和FPV母源抗体影响所致。在以上的免疫效力试验中同时辅以工FN一11作为免疫佐剂，经过比较可知，IFN可以降低重组鸡痘病毒对雏鸡增重的影响。综上所述，本室研制的表达NDV凡E，株F、HN基因的重组鸡痘病毒在遗传稳定性及免疫保护效力方面达到《兽医生物制品检验规程》的标准，可望成为防制新城疫的一种新型疫苗。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
目录  7-8
符号说明  8-9
综述: 新城疫基因工程苗研究进展  9-20
第一章表达新城疫病毒F、HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性试验  20-29
  1 材料和方法  20-23
  2 结果  23-25
  3 讨论和小结  25-28
  4 参考文献  28-29
第二章表达新城疫病毒F、HN基因重组鸡痘病毒疫苗的免疫效力试验  29-43
  1 材料和方法  30-31
  2 结果  31-36
  3 讨论和小结  36-40
  4 参考文献  40-43
第三章检测新城疫融合蛋白抗体的间接ELISA和竞争ELSIA方法的初步建立  43-51
  1 材料和方法  43-45
  2 结果  45-49
  3 讨论和小结  49-50
  4 参考文献  50-51
致谢  51

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