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南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性的分析及VP4重组蛋白免疫效果初步研究

作　者: 迟妍妍
导　师: 叶星
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 草鱼呼肠孤病毒双重PCR 分析 VP4蛋白抗原性基因工程疫苗
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的重要品种,其产量约占淡水养殖总产量的20%,在我国农业经济中具有重要的意义。但是其养殖期间易发生出血病,导致高死亡率,常造成草鱼养殖业的巨大损失。本实验室最近在广东养殖草鱼患出血病病鱼体上分离到一株病毒株(暂命名为GCRV-GD108),人工感染实验显示该毒株对草鱼具有强致病性。病毒全基因组测序的结果显示该株与已报道的GCRV以及其它水生呼肠孤病毒属已知种的序列存在较大差异。本研究在此基础上检测南方草鱼主养区病毒株的分子特性,并建立双重PCR检测方法,通过一次PCR反应鉴别病毒株属于GCRV或GCRV-GD108。同时制备外衣壳蛋白VP4的重组蛋白,开展重组蛋白免疫原性与保护作用分析。本研究为草鱼病毒性出血病的有效防控奠定基础。1.南方各毒株样品的分子特性分析根据本实验室前期研究所获得的GCRV-GD108株的序列,设计了针对每个节段的扩增引物,RT-PCR方法扩增采自广东、福建和湖南等地的病毒株。结果显示各样品相互间、样品与GCRV-GD108株间11个节段序列均具有较高的同源性。各样品序列两两间的相似性为95.2%~99.4%,各样品与GCRV-GD108株序列的相似性在95.0%~ 99.8%间;样品间同源性最高的为S9片段,L3片段的同源性最低,各样品M4片段间的差异较大。本研究说明目前南方多个地区的草鱼出血病病毒均具有与GCRV-GD108株相似的分子特征,提示GCRV-GD108株是南方省市的主要代表性流行毒株。此外,还进行了病毒感染组织特异性的分析,结果显示各组织样品均能检测到特异条带,说明各组织中均感染有病毒。2.双重PCR扩增方法的建立在上述检测基础上筛选合适引物对,以健康草鱼、GCRV标准株以及GCRV-GD108株基因组RNA为模板,反转录所获得的cDNA进行双重PCR扩增,结果显示健康草鱼无特异条带产生,GCRV标准株样品均有450 bp左右的条带,而GCRV-GD108株则出现了与各对引物预期大小相符的条带。同时进行了灵敏性分析,结果显示可扩增到浓度为5.07×10-9μg/ml的模板。说明该方法具有较高的灵敏性与特异性,通过一次PCR反应可鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株,该方法适用于生产上大批量草鱼样品的检测,可在短时间内确定感染病毒的分子特性,以便采取相应的防控措施。3.GCRV-GD108 M6基因的克隆、抗原性分析及重组蛋白制备本研究克隆GCRV-GD108的M6节段。M6基因全长2028bp,含一个开放阅读框(ORF)1716bp。M6基因的编码蛋白VP4与GenBank上已登录的GCRV标准株VP4序列同源性为47.4%。Blast分析显示VP4蛋白具有Reovirus M2超家族的主要结构域(Reovirus major virion structural protein Mu-1/Mu-1C (M2) superfamily),该蛋白家族在病毒的结构和功能的行使上起重要作用,是病毒的外衣壳蛋白,在病毒的膜穿透过程中起作用,推测GCRV-GD108 VP4具有相似的功能。用DNAstar软件预测M6抗原区,显示其具有28个抗原表位,提示VP4具有较强的抗原性。本研究进一步采用基因工程技术制备重组重组VP4蛋白。根据M6的ORF序列设计引物,将VP4编码序列克隆至表达载体中构建重组原核表达载体pET32a-VP4,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量大小为87kDa的His-VP4融合蛋白。本研究为下一步开展GCRV-108的致病性和感染机制研究,并有效防止草鱼出血病爆发奠定基础。4.重组蛋白免疫原性与保护作用评价重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔制备多克隆抗体,经Elisa检测,抗体效价达到1:64000以上,说明重组蛋白VP4具有较好的免疫原性。用此重组蛋白免疫草鱼,受免鱼免疫14 d后进行人工攻毒,结果表明重组VP4蛋白对病毒感染有较好的保护效果,3μg/g注射量的保护率可达到82%。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-14
引言  14-31
  1 草鱼呼肠孤病毒的特性  14-20
    1.1 草鱼呼肠孤病毒的分类地位及形态特征  14-15
    1.2 病毒的结构  15-16
    1.3 草鱼呼肠孤病毒的致病性  16-17
    1.4 草鱼呼肠孤病毒的检测  17-18
    1.5 草鱼呼肠孤病毒的免疫防治  18-20
  2 鱼用疫苗研究现状  20-29
    2.1 常规疫苗  20-21
    2.2 基因工程亚单位疫苗  21-24
    2.3 基因缺失活疫苗或突变苗  24-25
    2.4 活载体疫苗  25-26
    2.5 DNA 疫苗  26-29
  3 本研究目的与意义  29-31
第一章南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性分析及双重PCR 检测方法的建立  31-42
  1 材料与方法  31-35
    1.1 实验鱼及病毒  31
    1.2 主要试剂  31
    1.3 引物设计与合成  31-32
    1.4 病毒分离  32-33
    1.5 病毒RNA 提取  33
    1.6 RT-PCR  33-34
    1.7 病毒核酸序列比较  34
    1.8 双重PCR 检测方法的建立  34-35
  2 结果与分析  35-40
    2.1 病毒感染实验结果  35
    2.2 各样品病毒分子特性分析  35-38
    2.3 病毒组织特异性分析  38
    2.4 双重PCR 扩增方法的建立  38-40
  3 讨论  40-42
第二章草鱼呼肠孤病毒广东株(GCRV-GD108) M6 基因的克隆、原核表达及免疫原性分析  42-60
  1 材料与方法  42-55
    1.1 供试鱼、菌株、宿主菌和质粒  42
    1.2 主要试剂  42-47
    1.3 M6 基因的克隆与序列分析  47
    1.4 M6 基因编码蛋白的抗原性分析  47
    1.5 重组质粒的构建及表达  47-50
    1.6 重组质粒的构建  50-51
    1.7 重组质粒pET32a-VP4 和表达菌株pET32a-VP4-BL21(DE3)的获得  51-52
    1.8 重组蛋白pET32a-VP4 的诱导、表达、纯化  52-53
    1.9 免疫兔制备多克隆抗体及Elisa 测定抗体效价  53-54
    1.10 重组蛋白pET32a-VP4 的免疫保护试验  54-55
  2 结果与分析  55-58
    2.1 基因序列分析  55
    2.2 抗原性分析  55-57
    2.3 重组蛋白的表达纯化  57
    2.4 多克隆抗体制备及ELISA 检测  57
    2.5 融合蛋白对草鱼的免疫保护作用  57-58
  3 讨论  58-60
总结  60-61
参考文献  61-67
附录A 缩略词表  67-68
附录B pET32a 载体图谱  68-69
附录C 在读期间发表文章  69-70
致谢  70

南方养殖草鱼呼肠孤病毒分子特性的分析及VP4重组蛋白免疫效果初步研究

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