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十字花科黑腐病菌colRS双组分调控系统基因的研究

作　者: 张穗生
导　师: 唐纪良
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 十字花科黑腐病菌 双组分调控系统 定殖 colRS基因 抗逆性 致病性 过敏反应 基因表达
分类号: S432.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


十字花科黑腐病菌,学名为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）,是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌,能在世界范围侵染十字花科植物,给农业生产造成重大损失。该菌易于培养、保存,具有较好的遗传操作性,是研究微生物与寄主相互作用分子机理的重要模式细菌之一。Xcc属于典型的维管束病害病原菌,病菌通过水孔或伤口侵入植物体内,并在维管束木质部导管中扩展,导致系统病害。致病过程包括接触、识别、侵入、繁殖、扩展、显症等阶段,是一个复杂的、动态的多因子的相互作用过程。在整个侵染循环中,Xcc要历经腐生、附生和寄生阶段,经历着很大的环境变化,不断地与寄主以及环境因素发生互作。研究表明,在侵入寄主之前,在叶表成功定殖有利于病原菌侵入寄主体内。根据研究报道,colR、colS（合称colRS）双组分调控系统在荧光假单胞菌WCS365菌株（Pseudomonas fluorescens WCS365）、恶臭假单胞菌KT2440（Pseudomonas putida KT2440）菌株中参与调节细菌在植物根际定殖过程。colS的编码蛋白ColS感受外界刺激,传递磷酸基团至colR的编码蛋白ColR,ColR调节其它基因表达。除了影响定殖外,目前了解到colR基因调节细菌抗逆性,colR与恶臭假单胞菌CD2菌株对重金属的抗逆性和恶臭假单胞菌PaW85菌株（Pseudomonas putida PaW85）对酚的抗逆性相关;colRS参与调节恶臭假单胞菌PaW85菌株Tn4652转座子转座等。双组分调控系统是细菌对环境变化做出应对的重要的调节基因,参与调节定殖、生长发育、抗逆性、致病性等多种细胞活动和功能。因此,双组分调控系统相关的基因及产物被认为是未来发展控制细菌病害的理想药物靶标。然而,迄今尚未有与定殖相关植物病原细菌双组分调控系统基因的报道。在完成了Xcc 8004菌株全基因组序列测定的基础上,为了弄清该菌基因组中是否存在colRS基因的同源基因,我们用已报道的假单胞菌colRS基因编码的蛋白质序列对Xcc 8004全基因组数据库进行Blast搜索。结果表明,在Xcc 8004菌株基因组中,搜索到与已报道的colR、colS相似性很高的三对基因,XC1049和XC1050、XC3125和XC3126、XC3451和XC3452。为了了解这些基因是否与定殖相关,通过定点整合突变的方式,构建了以上六个基因的突变体NK1049、NK1050、NK3125和NK3126、NK3451和NK3452。植株实验检测结果表明,突变体NK1049定殖能力显著下降,将带有XC1049基因的pLAFR3导入NK1049突变体,能成功互补NK1049。表明XC1049基因与Xcc在寄主叶表定殖有关,故将XC1049命名为colRXcc。植株实验还显示,NK1049致病性基本丧失,在寄主植物满身红萝卜中生长迟缓,在辣椒品种ECW-10R诱导过敏反应延迟、强度显著下降。其它基因的突变体表型与野生型Xcc 8004菌株表型基本一致。生理生化检测发现,在重金属、有机溶剂、渗透压、酸碱胁迫下,突变体NK1049可以忍受的胁迫水平明显低于野生型菌株Xcc 8004,colRXcc对Xcc 8004抗逆性具有显著影响;与Xcc 8004、互补株CNK1049相比,突变体NK1049在NYGB培养基、MMX培养基中生长较慢。其它检测如营养缺陷型检测、泳动观察、生物膜形成检测、胞外蛋白酶,胞外淀粉酶、胞外纤维素酶和胞外多糖等Xcc的致病因子检测没有发现突变体与Xcc8004有明显差异。抗生素抗性分析结果表明,突变体NK1049比Xcc 8004对抗生素敏感,细菌细胞外膜渗透性可能改变;多粘菌素与细胞外膜脂多糖结合影响膜渗透性,NK1049对多粘菌素（polymyxin）敏感,colRXcc可能改变脂多糖功能而影响膜的渗透性。RT-PCR分析发现,colRXcc调节hrp,基因表达,colRXcc突变后hrpC、hrpE转录单元表达量显著降低。总之,本研究鉴定了十字花科黑腐病菌的一个与叶表定殖有关的基因colRXcc。实验表明,colRXcc与定殖、致病性、抗逆性及细胞生长相关,且调控该菌的hrp致病系统基因的表达。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 绪论  11-29
  1.1 植物病原细菌的致病机理研究  11-16
    1.1.1 主要的植物病原细菌  11-13
    1.1.2 病原细菌的侵染过程  13-14
    1.1.3 植物病原细菌的致病生化因子及致病相关基因  14-16
  1.2 双组分调控系统  16-25
    1.2.1 双组分调控系统的序列特征  17-19
    1.2.2 双组分调控系统的分布  19
    1.2.3 双组分调控系统的调控机理  19-22
    1.2.4 双组分调控系统的功能  22-24
    1.2.5 双组分调控系统是理想的药物候选靶标  24-25
  1.3 十字花科黑腐病菌及其双组分调控系统基因  25-27
    1.3.1 十字花科黑腐病菌  25-26
    1.3.2 十字花科黑腐病菌基因组注释的双组分调控系统基因  26-27
    1.3.3 已报道的Xcc双组分调控系统基因  27
  1.4 本研究的主要内容、目的和意义  27-29
    1.4.1 本研究的主要内容  27
    1.4.2 本研究的目的和意义  27-29
第二章 材料与方法  29-49
  2.1 研究用菌株和质粒  29-30
  2.2 常规微生物学操作  30-34
    2.2.1 培养基  30-31
    2.2.2 培养条件  31
    2.2.3 菌株的保存  31
    2.2.4 常用抗生素  31-32
    2.2.5 突变体营养缺陷型检测  32
    2.2.6 胞外多糖的检测  32-33
    2.2.7 胞外酶的检测  33-34
    2.2.8 Xcc生长曲线的测定  34
  2.3 分子操作技术  34-47
    2.3.1 常用试剂、溶液、缓冲液  34-36
    2.3.2 DNA分子生物学操作  36-41
    2.3.3 聚合酶链式反应(PCR)  41-43
    2.3.4 十字花科黑腐病菌总RNA提取  43-45
    2.3.5 细菌的转化与接合实验  45-47
  2.4 植株试验  47-49
    2.4.1 植株材料  47
    2.4.2 器皿与工具  47
    2.4.3 致病性试验  47-48
    2.4.4 过敏反应  48-49
    2.4.5 从叶片回收细菌及叶内生长曲线  49
第三章 Xcc基因组中colRS同源基因分析  49-56
  3.1 Xcc 8004基因组中colRS的同源基因  49-51
  3.2 colS和colR同源基因在Xcc 8004基因组中的遗传结构  51
  3.3 Xcc 8004 colS和colR同源基因编码ColS和ColR的结构域  51-53
  3.4 colRS同源基因产物保守结构域氨基酸序列多重比对  53-54
  3.5 Xcc 8004 colS同源基因产物的跨膜结构分析  54-55
  3.6 小结  55-56
第四章 colRS同源基因突变体构建及其在寄主叶表定殖分析  56-67
  4.1 Xcc 8004 colRS同源基因突变体构建  56-62
    4.1.1 整合突变体构建的原理  56-58
    4.1.2 Xcc 8004 colRS同源基因整合突变体构建  58-62
  4.2 Xcc 8004 colRS同源基因突变体在寄主叶表定殖分析  62-63
  4.3 NK1049突变体的遗传互补  63-66
    4.3.1 互补载体的制备  64
    4.3.2 PCR扩增互补基因片段  64-65
    4.3.3 pLAFR3互补重组质粒的酶切验证  65-66
    4.3.4 互补菌株在寄主叶表定殖分析  66
  4.4 小结  66-67
第五章 colR_(Xcc)突变体的基本生理、代谢表型  67-73
  5.1 NK1049不是营养缺陷型突变体  67
  5.2 colR_(Xcc)突变不影响Xcc 8004菌株的运动能力  67-68
    5.2.1 半固体培养基平板检测泳动  67-68
    5.2.2 显微观察细菌的运动  68
  5.3 colR_(Xcc)突变不影响Xcc胞外酶和胞外多糖的产生  68-70
    5.3.1 供试Xcc菌株菌液的准备  68
    5.3.2 胞外蛋白酶的检测  68-69
    5.3.3 胞外淀粉酶的检测  69
    5.3.4 胞外纤维素酶的检测  69-70
    5.3.5 胞外多糖的检测  70
  5.4 生物膜形成检测  70-71
  5.5 NK1049突变体在液体培养基中的生长状况  71-72
  5.6 NK1049突变体膜的渗透性分析  72
  5.7 小结  72-73
第六章 colR_(Xcc)与十字花科黑腐病菌的抗逆性有关  73-75
  6.1 NK1049抗重金属、有机溶剂、渗透压胁迫实验  73
  6.2 NK1049抗酸碱胁迫实验  73
  6.3 小结  73-75
第七章 colR_(Xcc)与Xcc的致病性和HR反应相关  75-78
  7.1 NK1049对寄主植物的致病力显著降低  75
  7.2 NK1049在植物中的生长显著降低  75-76
  7.3 NK1049在非寄主植物辣椒ECW-10R的HR反应显著降低  76-77
  7.4 小结  77-78
第八章 colR_(Xcc)与hrp基因的表达调控关系  78-82
  8.1 RT-PCR验证colR_(Xcc)突变对hrp基因转录的影响  78-79
  8.2 colR_(Xcc)对hrpG和hrpX基因转录无明显影响  79
  8.3 colR_(Xcc)正调控hrpC和hrpE转录单元的表达  79
  8.4 hrpG或hrpX对colR_(Xcc)基因的表达无明显影响  79
  8.5 小结  79-82
第九章 讨论与结论  82-86
  9.1 colR_(Xcc)与Xcc的定殖有关  82-83
  9.2 colR_(Xcc)影响Xcc的抗逆性  83
  9.3 colR_(Xcc)影响Xcc的生长速率  83
  9.4 colR_(Xcc)影响Xcc侵染植物的能力  83
  9.5 colR_(Xcc)调节膜渗透性  83-84
  9.6 colR_(Xcc)可能调控hrp基因表达  84
  9.7 colR是一个重要的双组分调控系统基因  84-86
参考文献  86-101
附件  101-109
  附表1 colR_(Xcc)突变体验证PCR产物测序  101-105
  附表2 互补colR_(Xcc)DNA片段测序  105-109
致谢  109

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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