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C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 孙慧慧
导　师: 朴君
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 动物学
关键词: c-myc 免疫单克隆抗体肿瘤
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要

原癌基因c-myc是myc家族的重要成员之一,是髓细胞性白血病病毒的癌基因v-myc的细胞同类物,定位于染色体8q24.12-8q24.13,其编码产物c-myc蛋白的分子量为62kDa。c-myc基因的功能甚多,它既是一种可易位基因,又是一种受多种物质调节、可使细胞无限增殖、获永生化功能、促进细胞分裂的可调节基因,在很多肿瘤中都高表达。在正常细胞中的c-myc原癌基因一旦被激活,转为癌基因,活化转录和翻译,c-myc mRNA和c-myc蛋白的表达便异常增高,使细胞脱离正常生长的调节限制而具有高度增生潜能,向恶性表型转化,抑制细胞分化,促进细胞恶变,最后导致肿瘤的发生。鉴于c-myc的过表达与肿瘤发生呈高度正相关,c-myc抗血清可以应用于肿瘤的诊断,本研究通过制备c-myc单克隆抗体,为肿瘤诊断试剂盒的研发提供基础实验数据。用原核表达及纯化的c-myc蛋白抗原免疫3只健康雌性BALB/c小鼠,3次免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以10:1比例进行细胞融合,再经HAT选择培养基筛选、间接ELISA方法检测、有限稀释法克隆,最终获得2株能够稳定分泌抗c-myc特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并分别命名为SHH-1H11和SHH-2A9。抗体亚型鉴定表明,SHH-1H11、SHH-2A9分别为IgG1亚类和IgM。经BCA Protein Assay Reagent Kit检测显示,杂交瘤细胞SHH-1H11上清和腹水的抗体浓度分别为0.47mg/ml和2.51mg/ml,SHH-2A9的上清和腹水的抗体浓度分别是0.49mg/ml和2.45mg/ml。ELISA检测结果显示,这两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5120;小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000,c-myc单克隆抗体只与c-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,这表明获得的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性。本研究为肿瘤诊断试剂盒的研发提供了良好的技术基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
引言  8-17
1 材料与方法  17-27
  1.1 材料  17-21
    1.1.1 实验动物和细胞  17
    1.1.2 主要试剂  17-18
    1.1.3 仪器设备及耗材  18
    1.1.4 试剂配制  18-21
  1.2 方法  21-27
    1.2.1 双酶切PET28a 质粒载体的构建  21
    1.2.2 c-myc 抗原的IPTG 诱导表达与纯化  21-22
    1.2.3 Western Blot  22
    1.2.4 动物免疫  22
    1.2.5 小鼠血清收集  22
    1.2.6 ELISA 法检测抗血清效价  22-23
    1.2.7 细胞培养  23
    1.2.8 滋养细胞的制备  23
    1.2.9 免疫脾细胞悬液的制备  23-24
    1.2.10 细胞融合  24
    1.2.11 阳性杂交瘤细胞的筛选  24
    1.2.12 阳性杂交瘤细胞的亚克隆  24-25
    1.2.13 阳性杂交瘤细胞的扩大化培养  25
    1.2.14 单克隆抗体的大量制备  25
    1.2.15 单克隆抗体的鉴定  25-27
2 结果  27-39
  2.1 原核表达及纯化的c-myc 蛋白  27-29
  2.2 3 次免疫后小鼠血清效价检测  29-30
  2.3 SP2/0 骨髓瘤细胞  30
  2.4 小鼠脾细胞  30-31
  2.5 滋养细胞  31-32
  2.6 融合细胞  32-33
  2.7 亚克隆细胞  33-34
  2.8 杂交瘤细胞上清液及腹水单抗效价的检测  34-35
  2.9 单抗的亚型鉴定  35-36
  2.10 杂交瘤细胞上清和腹水中抗体浓度的测定  36-37
  2.11 腹水抗体分子量的测定  37
  2.12 杂交瘤细胞染色体  37-39
3 讨论  39-42
结论  42-43
参考文献  43-47
附录A Western Blot  47-49
附录B 杂交瘤细胞染色体鉴定  49-50
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  50-51
致谢  51

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

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