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RNA干扰抑制大鼠背根神经节细胞的TRPV4表达与功能

作　者: 刘婷婷
导　师: 岳寿伟
学　校: 山东大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 背根神经节细胞模型机械刺激 RNA干扰 TRPV4 钙离子通道机械痛 TRPV4离子通道蛋白质印迹
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

第一部分有效转染DRG细胞TRPV4SiRNA的浓度筛选目的:建立大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞基因转染细胞模型,观察在SiRNA转染下培养24h和48h的神经元形态和活性的变化,筛选这种神经元siRNA转染的浓度。方法:取新生Wistar大鼠腰背段全部DRG,将处理好的DRG神经元进行培养,根据时间,将神经元随机分为正常对照组、SiRNA不同浓度组、在SiRNA中培养相应时间后观察各组神经元在荧光显微镜的形态学特点,并用MTT法分析各组神经元细胞生长活性的改变。另外采用结果:荧光显微镜下观察SiRNA转染培养组DRG神经元形态较正常组五无明显差异。MTT法比较10-40nM各组神经元活性的差异无统计学意义。利用FLUO3荧光探针,观察SiRNAa作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应,采用ELISA方法观察KCL刺激下各组细胞释放P物质的改变,结论:40-80nMSiRNA可以有效转染DRG细胞,并对细胞内游离钙对低渗溶液的反应产生影响,并且对释放P物质也有抑制作用,同时未对DRG神经元活性产生显著影响,此方法有望成为一种在分子水平研究TRPV4通道对DRG神经元的影响的有效细胞模型。第二部分RNA干扰抑制大鼠背根神经节细胞的TRPV4表达目的TRPV4(transient receptor potential vanilloid 4)是大鼠背根神经节伤害性传导的重要感受器,本实验拟应用体外转录合成的SiRNA转染原代培养背根神经节神经元,诱导非选择性钙离子通道TRPV4基因表达沉默,观察对TRPV4表达以及功能的影响,探讨以TRPV4为靶点、采用RNA干扰的方法进行疼痛研究的应用前景,为TRPV4的功能研究提供新的方法。方法根据RNA干扰的原理及SiRNA的设计原则,设计2对长度为19bp的TRPV4基因SiRNA(SiRNAa和SiRNAb),另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA体外转录合成SiRNA,将SiRNA转染体外培养背根神经节神经元,采用荧光定量RT-PCR,Western blot检测TRPV4mRNA以及蛋白的表达。结果SiRNA可以有效转染DRG细胞,并在低渗条件下引起细胞TRPV4表达的明显降低。SiRNAa和SiRNAb可以分别使得TRPV4mRNA降低,在低渗状态下,对照组与错配组mRNA的表达均明显增高,分别为正常细胞外液的3.88以及3.75倍。而SiRNAa组则为1.26倍,SiRNAb组为1.87倍,明显抑制了TRPV4的mRNA表达(P=0.0187,P＜0.05)。对照组与错配组蛋白表达的表达均明显增高,分别为正常细胞外液的3.26倍以及3.56倍。而SiRNAa为1.01倍,SiRNAb为1.28倍,也表现出明显的抑制作用(P=0.0028,P＜0.05)。以上实验筛选出A序列更为有效。结论TRPV4是一个在低渗状态信号转导的重要组成部分。本实验所设计的SiRNA可以在DRG神经元内有效抑制TRPV4mRNA和蛋白的表达水平,并且可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成为TRPV4相关的病理状态,尤其是疼痛的潜在治疗方式。本实验筛选出的序列SiRNAa将为以后的实验提供实验依据。第三部分:大鼠背根神经节上TRPV4通道蛋白功能的抑制背景TRPV4在炎性痛和神经痛感觉传导中有重要的作用,我们既往的研究也表明,TRPV4在背根神经节慢性受压的病理改变中也起到一定的作用。尽管我们在以上的实验中观察到TRPV4SiRNA可以有效抑制mRNA和蛋白的表达,但是我们对TRPV4SiRNA是否能抑制其功能并不明确。本实验拟应用体外转录合成的SiRNA转染原代培养背根神经节神经元,观察TRPV4的功能改变。方法SiRNAa另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA体外转录合成SiRNA,将SiRNA转染体外培养背根神经节神经元,采用共聚焦显微镜的方法,利用FLUO3荧光探针,观察SiRNAa作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应,采用ELISA方法观察KCL刺激下各组细胞释放P物质的改变,同时本实验采用细胞免疫化学的方法观察了TRPV4与PKC表达的相关性。结果DRG细胞中钙浓度变化,30%低渗溶液引起的DRG细胞中钙浓度峰值在对照组以及错配组中均有明显的升高,(p＜0.01).而与以上两组对照,SiRNAa组DRG对低渗溶液的反应明显降低,p＜0.01。P物质释放的检测结果表明,Kcl刺激前后,对照组以及错配组有明显的P物质释放增多,SiRNAa以及SiRNAb组则出现明显的抑制作用(P=0.023,P＜0.05)。免疫细胞化学的结果表明SiRNA组细胞荧光明显降低减弱.光密度值检测有统计学意义.(p＜0.05).结论TRPV4是一个在低渗状态信号转导的重要组成部分。本实验所设计的SiRNA可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成为TRPV4相关的病理状态,尤其是疼痛的潜在治疗方式。本实验筛选出的序列SiRNAa将为以后的实验提供实验依据。序列;为以后的研究奠定基础。另一方面,明确RNAi是否可以在DRG细胞中有效抑制TRPV4基因和蛋白的表达,同时抑制TRPV4的功能活性。

全文目录

符号说明  7-8
第一部分有效转染DRG细胞TRPV4SiRNA的浓度筛选  8-22
  中文摘要  8-9
  ABSTRACT  9-10
  1.1 选题背景  10-12
  1.2 材料与方法  12-16
  1.3 结果  16-17
    1.3.1 大鼠DRG细胞的观察  16
    1.3.2.荧光标记SiRNA转染DRG神经元  16-17
    1.3.3 siRNA对DRG细胞活性的影响  17
    1.3.4.DRG细胞中钙浓度变化  17
    1.3.5 P物质释放的检测结果  17
  1.4 讨论  17-21
  1.5 结论  21-22
第二部分 RNA干扰抑制大鼠背根神经节细胞的TRPV4表达  22-38
  中文摘要  22-23
  ABSTRACT  23-24
  2.1 前言  24-25
  2.2 材料与方法  25-31
    2.2.1 主要试剂及仪器设备  26
    2.2.2 实验步骤  26-31
    2.2.3 统计学处理  31
  2.3 结果  31-32
    2.3.1 Q-RT-PCR检测TRPV4表达结果  31-32
    2.3.3 蛋白表达结果  32
  2.4 讨论  32-37
  2.5 结论  37-38
第三部分:大鼠背根神经节上TRPV4通道蛋白功能的抑制  38-53
  中文摘要  38-39
  ABSTRACT  39-40
  3.1 前言  40-44
  3.2 材料和方法  44-47
    3.2.1 DRG细胞培养  44-45
    3.2.2 转染实验  45
    3.2.3 游离钙图象  45-46
    3.2.4 P物质释放试验  46
    3.2.5 间接免疫荧光法染色  46-47
  3.3 结果  47
    3.3.1.DRG细胞中钙浓度变化  47
    3.3.2.P物质释放的检测结果  47
    3.3.3 免疫细胞化学的结果表明  47
  3.4 讨论  47-52
  3.5 结论  52-53
附表和附图  53-56
参考文献  56-64
Effects of density of TRPV4 S iRNA on rat dorsal root ganglion  64-70
Inhibition of the expression and function of TRPV4 by RNA interference in dorsal root ganglion  70-77
综述:RNA干扰技术在神经痛研究中的应用进展  77-85
攻读学位期间发表的文章  85-86
致谢  86-87
学位论文评阅及答辩情况表  87

RNA干扰抑制大鼠背根神经节细胞的TRPV4表达与功能

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