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蕨麻正丁醇部位对大鼠心肌细胞缺氧所致钙超载的抑制作用及机制研究

作　者: 王鲁君
导　师: 李灵芝
学　校: 河北医科大学
专　业: 药理学
关键词: 蕨麻正丁醇部位 心肌细胞 缺氧 钙超载 肌浆网钙泵 钙依赖性的蛋白水解酶 钙离子通道
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:研究蕨麻正丁醇部位对大鼠心肌细胞缺氧所致钙超载的抑制作用,并探讨其可能的机制。方法:（1）取新生13d的SD大鼠,分离心肌细胞进行体外原代培养,建立心肌细胞缺氧损伤模型。（2）通过测定缺氧不同时间细胞内钙离子浓度的变化,确定心肌细胞的最佳缺氧时间及蕨麻正丁醇部位的给药浓度。（3）实验分为正常对照组、缺氧损伤模型组、蕨麻正丁醇部位高、中、低剂量（0.25mg/ml、0.0625mg/ml、0.0156mg/ml）干预组和阳性药物维拉帕米（5nmol/L）组。缺氧后利用荧光分光光度法和激光共聚焦技术检测细胞内钙离子浓度,观察各剂量蕨麻正丁醇部位干预组对心肌细胞缺氧所致钙超载的抑制作用。（4）通过检测细胞内Ca2+-ATP酶活性,RT-PCR技术检测各实验组SERCA2、PLB、Cav1.2、RyR、μ-Calpain mRNA表达差异,免疫细胞化学染色及Western Blot检测各组SERCA2、μ-Calpain蛋白表达差异,探讨其抑制作用的可能机制。结果:1大鼠原代培养心肌细胞形态学观察:倒置显微镜下,正常培养心肌细胞从第三天起成簇生长,搏动明显,细胞簇数量增多,细胞形状多样化,呈圆形、梭形及锥形,胞浆突起呈枝芽状,向细胞簇周围呈放射状生长,折光性强。缺氧损伤后,胞体折光性下降,搏动明显减弱。2大鼠心肌细胞缺氧损伤胞内钙离子浓度变化（1）心肌细胞缺氧时间的确立:随缺氧时间的延长,细胞内钙离子浓度升高,缺氧3h组细胞内钙离子浓度明显高于缺氧两小时组（P<0.01）。而缺氧4h组钙离子浓度与缺氧3h组相比无显著差异（P>0.05）,确定三小时为适宜缺氧时间点。（2）药物干预后胞内钙离子浓度变化:①荧光分光光度计测定细胞内游离钙离子浓度:缺氧3h后,缺氧损伤模型组（474.614±22.161）细胞内游离钙离子浓度与正常组（112.740±13.694）相比显著升高（P<0.01）。维拉帕米组（162.804±11.171）和蕨麻正丁醇部位高（230.467±21.111）、中（376.342±14.827）、低（413.721±14.306）剂量组均能显著降低心肌细胞内游离钙离子浓度,与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。②激光共聚焦技术检测心肌细胞内钙信号:缺氧损伤模型组（0.288±0.020）荧光强度与正常组组（0.074±0.014）相比显著升高（P<0.01）,维拉帕米组（0.076±0.010）和蕨麻正丁醇部位高剂量（0.132±0.007）组荧光强度与缺氧损伤模型组相比显著降低（P<0.01）。3细胞内Ca2+-ATPase酶活力变化:缺氧损伤模型组心肌细胞内Ca2+-ATPase酶活力（2.404±0.151）与正常组（5.381±0.271）相比显著降低（P<0.01）,维拉帕米组（4.485±0.202）和蕨麻正丁醇部位高（4.674±0.250）、中（3.433±0.123）、低（3.031±0.203）剂量组均能显著提高心肌细胞内Ca2+- ATPase酶活力,与缺氧损伤模型组相比有显著性差异（P<0.01）。4与钙信号相关基因的表达变化（1）RT-PCR:缺氧损伤模型组SERCA2 mRNA表达较正常组显著降低（P<0.01）;与缺氧损伤模型组比较,蕨麻正丁醇部位各剂量组和维拉帕米组SERCA2 mRNA表达水平均显著升高（P<0.01）。缺氧损伤模型组RyR、Cav1.2、Calpain-1 mRNA较正常对照组表达升高（P<0.01） ;与缺氧损伤模型组相比,蕨麻正丁醇部位各剂量组RyR mRNA （P<0.01）、Cav1.2 mRNA、μ-Calpain mRNA （高、中剂量组P<0.01;低剂量组P<0.05）表达均降低。各实验组PLB mRNA表达无显著性差异（P>0.05）。（2）免疫细胞化学染色:与正常对照组比较,缺氧损伤模型组心肌细胞SERCA2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,μ-Calpai蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与缺氧损伤模型组比较,蕨麻正丁醇部位高中低剂量组和维拉帕米组心肌细胞SERCA2蛋白表达量均增加（P<0.01）,μ-Calpain蛋白表达均降低（高、中剂量组P<0.01;低剂量组P<0.05）。（3）Western blot:缺氧损伤模型组心肌细胞SERCA2蛋白表达水平较正常组显著降低（P<0.01）,μ-Calpai蛋白表达水平较正常组显著升高（P<0.01）。与缺氧损伤模型组比较,蕨麻正丁醇部位各剂量组和维拉帕米组均可提高缺氧心肌细胞SERCA2蛋白表达量（P<0.01）。蕨麻正丁醇部位高、中剂量组和维拉帕米组均可降低μ-Calpain蛋白表达（P<0.01）,低剂量组与模型组相比无显著性差异（P>0.05）。结论:缺氧3h心肌细胞内钙离子浓度显著升高,蕨麻正丁醇部位能明显改善缺氧所致的钙超载,对心肌细胞具有保护作用。这种保护作用的机制可能是提高Ca2+-ATP酶活力,增加肌浆网对钙离子的重摄取能力;抑制L型钙通道,减少外钙内流,从而减少由此诱导的肌浆网钙离子大量释放;通过抑制钙超载的发生,降低钙依赖性的蛋白水解酶（μ-Calpain）的表达,进一步保护心肌细胞。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
英文缩写  12-14
研究论文 蕨麻正丁醇部位对大鼠心肌细胞缺氧所致钙超载的抑制作用及机制研究  14-78
  前言  14-16
  材料与方法  16-32
  结果  32-37
  附图  37-66
  讨论  66-75
  参考文献  75-78
综述  78-91
致谢  91-92
个人简历  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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