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食管鳞癌中肿瘤相关基因的甲基化研究

作　者: 李博
导　师: 邱长春
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 食管鳞癌 甲基化 DNA甲基转移酶 肿瘤标志物 SFRPs 启动子 Wnt信号通路 ASE RNA混合池
分类号: R735.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


第一部分食管鳞癌甲基化谱及其作为肿瘤标志物的研究背景：近年来DNA高度甲基化被公认为是食管鳞癌发病的最常见分子机制之一。然而DNA甲基转移酶在参与这种分子异常改变中的重要作用和多基因的高度甲基化作为新型肿瘤标志物的潜在可能性仍然不清楚。方法：本文通过甲基化特异性PCR研究了47例食管鳞癌患者癌与癌旁正常组织中12个肿瘤相关基因启动子区的甲基化状态,并通过亚硫酸盐测序的方法进一步证实甲基化CpG位点的存在。为了评价DNA甲基转移酶与DNA高度甲基化谱的关系,通过荧光定量反转录PCR分析了三种DNA甲基转移酶基因(DNMT1,DNMT3α和DNMT3b)的nRNA表达水平,并通过免疫组织化学进一步分析了DNMT3b蛋白表达水平。为了探讨肿瘤相关基因甲基化作为肿瘤标志物的可能性,通过甲基化荧光定量PCR分析了45例食管鳞癌患人和15例正常对照健康人中5个高甲基化基因(p16,CDH1,RASSF1A,DAPK,和RAR-β)在血清游离DNA中的甲基化水平。结果：97.9%(46/47)的食管鳞癌组织至少存在一个基因发生高度甲基化。在肿瘤组织中单个基因的甲基化频率依次为：RAR-β为46.8%；DAPK为46.8%；p16为44.7%；CDH1为42.6%;RASSF1A为14.9%；p14为14.9%；TIMP-3为14.9%；APC为12.8%；MGMT为12.8%；FHIT为6.4%；GSTP1和ADAM23为0%,而在癌旁正常组织中未发现高的甲基化频率。多个基因的甲基化与病人一些临床病理特征显著相关。在肿瘤组织中,DNMT3b的mRNA和蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织(P=0.005和P<0.001),同时DNMT3b的mRNA过表达显著与多基因的高度甲基化显著相关(P=0.021)。当同时考虑DNMT1和DNMT3b过表达时,这种显著相关性更强(P=0.008),并且与肿瘤早期阶段(pT1-2)显著相关(P=0.01)。相对正常对照健康人,在食管鳞癌患者血清游离DNA中同样也发生了异常的高甲基化水平(CDH1为84.4%和20%,DAPK为73.3%和13.3%,RASSF1A为62.2%和6.7%,RAR-β为26.7%和13.3%,p16为6.7%和0%)。当2个及更多的高甲基化基因进行联合分析时,这种甲基化肿瘤标志物的灵敏度和特异性明显提高,具有较好的潜在诊断价值(ROC AUC 0.911,82.2%的灵敏度和100%的特异性)。结论：多个肿瘤相关基因的高甲基化可能参与了食管鳞癌的发生和发展,并且这种异常甲基化调控可能受上调表达的DNMT3b所介导。另外,食管鳞癌患者血清DNA中多个肿瘤相关基因的甲基化将可能作为一种新型的肿瘤标志物用于食管鳞癌的筛查和早期诊断。第二部分分泌型卷曲相关蛋白家族基因(SFRPs)甲基化与食管鳞癌相关性研究背景：分泌型卷曲相关蛋白家族(SFRPs)包括五种分泌型糖蛋白,并作为一类拮抗物参与Wnt信号调节。经典Wnt信号通路的异常激活是人类多种肿瘤的一个重要特征。因此Wnt通路负调节物SFRPs蛋白的异常改变可能参与了肿瘤的发生。在多种肿瘤中SFRPs基因的异常甲基化和表达沉默常发生,但在食管鳞癌中的研究尚未见报道。方法：本文通过甲基化特异性PCR分析了47例食管鳞癌患者癌与癌旁正常组织中SFRP家族基因4个成员(SFRP1,2,4和5)的启动子区甲基化状态,同时通过荧光定量反转录PCR评价了它们的mRNA表达水平。其次,实验通过甲基化特异性PCR和荧光定量反转录PCR分析了DNA甲基转移酶抑制剂(5-杂氮-2-脱氧胞苷)和组蛋白去乙酰化抑制剂(曲古菌素A)处理和未处理的食管鳞癌细胞系中SFRPs基因的甲基化状态和mRNA表达水平。通过亚硫酸盐基因组测序分析了SFRP1和SFRP5启动子区的甲基化水平。最后,实验分析了食管鳞癌组织中SFRPs甲基化与DNMTs上调表达的关系。结果：47例食管鳞癌患者肿瘤组织中SFRP1, SFRP2, SFRP4和SFRP5的甲基化频率依次为51.1%,61.7%,46.8%和44.7%,而在对应癌旁正常组织中的甲基化频率依次为23.4%,55.3%,34.0%和25.5%,仅SFRP1的高甲基化频率在两组中存在显著差异(P=0.01)。SFRP1的甲基化频率在小于5cm的肿瘤组织中显著更高(P<0.0001)。相对于癌旁正常组织,四个SFRPs基因中只有SFRP1在肿瘤组织中mRNA表达显著下调(P=0.026)。食管鳞癌细胞系经去甲基化药物和去乙酰化抑制剂联合处理后,沉默表达的SFRP1基因又重新恢复了表达。亚硫酸盐基因组测序进一步证实了在食管鳞癌组织和细胞系中SFRP1启动子区存在密集的甲基化位点。本研究并未发现食管鳞癌组中SFRPs的异常甲基化与DNMTs的mRNA表达上调显著相关。结论：SFRPs基因的高甲基化是食管鳞癌中一个常见的早期分子异常改变。在SFRPs家族基因中,SFRP1基因是食管鳞癌发生中一个主要的高频率表观失活靶点。异常的启动子甲基化导致SFRP1基因表达的功能性沉默。研究结果也提示SFRP1基因的甲基化沉默也许是食管鳞癌中Wnt信号通路异常激活的重要机制之一,并且可能作为食管鳞癌的一个标志物用于临床的诊治。第三部分食管鳞癌全基因组等位基因表达谱研究背景：等位基因特异表达(ASE)是表型差异的重要机制之一,并且这种现象存在于肿瘤细胞中。尽管X染色体失活和基因组印记这些染色体等位基因特异表达典型例子的生物学功能已经被熟知,但在人类食管鳞癌中全基因组的等位基因表达谱分析还没有被研究。方法：本文结合了高通量芯片分析和高效RNA混合池策略的SNP-MaP (SNP Microarrays and Pooling)方法,利用Affymetrix Genome-wide Human SNP Array 6.0对9例食管鳞癌与癌旁对照正常组织标本进行了全基因等位基因表达分析。通过基因群富集分析对差异表达基因进行了功能分类。同时通过甲基化特异性PCR对一些表达显著差异的基因进行了甲基化分析,并比较其ASE差异与甲基化的关系。结果：相对癌旁正常组织,食管鳞癌组织中基因组整体表达模式呈现下调的趋势。其中1526个基因发生了显著表达下调,463个基因则显著表达上调(P<0.01)。在下调的基因中,47.2%(721/1526)的基因存在显著ASE差异。表达下调基因主要分布在腺嘌呤核苷酸和钙离子结合基因、分子信号传导膜受体活性基因、细胞内质膜相关基因和神经系统认知与感应过程相关基因四类功能基因中。一些表达下调基因(APC,MGMT,RAR-β,CDKN2A和SFRP4)在肿瘤组织中都存在不同程度的甲基化(范围：11.1%-66.7%),同时这些基因存在显著ASE差异或强的趋势。结论：本研究证实Affymetrix Human SNP芯片和高效混合池策略结合的SNP-MaP能够有效地大范围分析人类食管鳞癌全基因组等位基因表达谱。在食管鳞癌中等位基因特异表达下调是一个常发的分子事件,并可能作为一种重要的机制参与人类食管鳞癌的发生。另外,结果提示表达下调基因的ASE差异可能与异常甲基化调节相关。1.本文首次发现多个肿瘤相关基因的异常甲基化可能参与中国食管鳞癌的发病,并且这种异常甲基化调节与表达上调的DNMT3b相关。2.本文首次在食管鳞癌患者血清DNA中发现多个肿瘤相关基因甲基化能够作为潜在的肿瘤标志物用于食管鳞癌的筛查和早期诊断。3.本文首次在食管鳞癌中发现SFRP1基因是一个重要的高频率甲基化靶点并且异常的启动子甲基化导致SFRP1基因表达的功能性沉默,同时提示SFRP1基因的甲基化沉默可能是食管鳞癌Wnt信号通路异常激活的重要机制之一。4.本文首次通过Affymetrix Human SNP芯片和高效混合池策略结合的SNP-MaP得到了人类食管鳞癌全基因组等位基因表达谱并发现等位基因特异表达下调常发生在食管鳞癌组织中,同时提示ASE差异可能与异常甲基化调节相关。

全文目录


目录  3-6
英文缩写词  6-9
中文摘要  9-13
  第一部分 食管鳞癌甲基化谱及其作为肿瘤标志物的研究  9-10
  第二部分 分泌型卷曲相关蛋白家族基因(SFRPs)甲基化与食管鳞癌相关性研究  10-11
  第三部分 食管鳞癌全基因组等位基因表达谱研究  11-12
  论文创新点  12-13
ABSTRACT  13-18
  Part Ⅰ  13-14
  Part Ⅱ  14-16
  Part Ⅲ  16-18
第一部分 食管鳞癌甲基化谱及其作为肿瘤标志物的研究  18-70
  1.1 前言  18-19
  1.2 材料  19-24
    1.2.1 临床组织和血标本  19-20
    1.2.2 菌株和质粒  20
    1.2.3 主要酶、生化试剂及溶液配制  20-23
    1.2.4 主要仪器设备  23-24
  1.3 方法  24-39
    1.3.1 引物和探针的设计和合成  24-27
    1.3.2 SssI修饰DNA的制备  27-28
    1.3.3 组织基因组DNA和血清游离DNA的提取  28-29
    1.3.4 DNA的亚硫酸钠修饰  29-31
    1.3.5 甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)  31
    1.3.6 MSP产物回收和纯化  31-32
    1.3.7 MSP产物的克隆  32
    1.3.8 阳性克隆重组体的筛选与鉴定  32-34
    1.3.9 亚硫酸盐测序  34
    1.3.10 组织总RNA的提取  34-35
    1.3.11 总RNA的反转录和荧光定量PCR  35-36
    1.3.12 免疫组织化学  36-37
    1.3.13 荧光定量甲基化特异性PCR(MethyLight Analysis)  37-38
    1.3.14 统计分析方法  38-39
  1.4 实验结果  39-61
    1.4.1 研究对象的临床病理参数  39-40
    1.4.2 基因组DNA亚硫酸钠修饰后质量评价  40
    1.4.3 食管鳞癌中肿瘤相关基因的甲基化谱分析  40-42
    1.4.4 MSP产物的克隆及亚硫酸盐测序分析  42-46
    1.4.5 食管鳞癌甲基化谱与临床病理参数相关性分析  46-47
    1.4.6 食管鳞癌组织中DNMT3b的高表达  47-54
    1.4.7 食管鳞癌组织中DNMTs表达与临床病理参数相关性分析  54-55
    1.4.8 食管鳞癌组织中多基因甲基化与DNMTs表达相关性分析  55-57
    1.4.9 血清游离DNA多基因的甲基化分析  57-59
    1.4.10 血清游离DNA多基因甲基化作为肿瘤标志物的诊断价值分析  59-60
    1.4.11 血清DNA多基因甲基化与临床病理参数相关性分析  60-61
  1.5 讨论  61-65
  1.6 参考文献  65-70
第二部分 分泌型卷曲相关蛋白家族基因(SFRPs)甲基化与食管鳞癌相关性研究  70-102
  2.1 前言  70-71
  2.2 材料  71-73
    2.2.1 临床组织标本  71
    2.2.2 实验细胞株  71-72
    2.2.3 菌株和质粒  72
    2.2.4 细胞培养试剂及材料  72
    2.2.5 主要酶、生化试剂及溶液配制  72-73
    2.2.6 主要仪器设备  73
  2.3 方法  73-80
    2.3.1 SFRPs基因启动子CpG岛预测  73
    2.3.2 引物的设计和合成  73-74
    2.3.3 SssI修饰DNA的制备  74
    2.3.4 人食管鳞癌细胞系培养  74-75
    2.3.5 细胞系去甲基化药物(DAC)和组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)处理  75-76
    2.3.6 组织和细胞基因组DNA的提取  76-77
    2.3.7 DNA的亚硫酸钠修饰  77
    2.3.8 甲基化特异性PCR(MSP)  77
    2.3.9 组织和细胞系总RNA的提取  77-78
    2.3.10 总RNA的反转录和荧光定量PCR  78-79
    2.3.11 亚硫酸盐基因组测序  79-80
    2.3.12 统计分析方法  80
  2.4 实验结果  80-95
    2.4.1 研究对象的临床病理参数  80
    2.4.2 基因组DNA亚硫酸钠修饰后质量评价  80
    2.4.3 食管鳞癌中SFRPs家族基因的甲基化分析  80-81
    2.4.4 食管鳞癌中SFRPs甲基化与临床病理参数相关性分析  81-85
    2.4.5 食管鳞癌中SFRPs甲基化与DNMTs表达相关性分析  85
    2.4.6 食管鳞癌中SFRPs基因的mRNA表达分析  85-88
    2.4.7 SFRPs的mRNA表达与临床病理参数相关性分析  88-90
    2.4.8 去甲基化药物(DAC)和组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)逆转SFRPs的表达  90-92
    2.4.9 SFRPs启动子区CpG岛亚硫酸盐测序分析  92-95
  2.5 讨论  95-98
  2.6 参考文献  98-102
第三部分 食管鳞癌全基因组等位基因表达潜研究  102-128
  3.1 前言  102-103
  3.2 材料  103-105
    3.2.1 临床组织和外周血标本  103
    3.2.2 芯片  103
    3.2.3 主要酶、生化试剂及溶液配制  103-104
    3.2.4 主要仪器设备  104-105
  3.3 方法  105-111
    3.3.1 外周血基因组DNA的提取  105
    3.3.2 组织总RNA的提取及质量评价  105
    3.3.3 DNA混合池的建立  105-106
    3.3.4 RNA混合池的建立及双链DNA的合成  106-107
    3.3.5 芯片杂交  107-111
    3.3.6 统计分析方法  111
  3.4 实验结果  111-121
    3.4.1 总RNA质量的评价  111
    3.4.2 表达与不表达等位基因的定义  111-112
    3.4.3 食管鳞癌与癌旁正常组织的杂合子位点全基因组表达模式  112-113
    3.4.4 等位基因表达差异与启动子甲基化关系分析  113-115
    3.4.5 全基因组等位基因位点表达差异与ASE差异的关系分析  115-119
    3.4.6 食管鳞癌中表达下调基因群的富集分析  119-121
  3.5 讨论  121-124
  3.6 参考文献  124-128
文献综述  128-147
  参考文献  140-147
致谢  147-148
博士期间发表和撰写的学术论文和会议摘要  148-149

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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