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丹酚酸A、黄连碱对糖代谢的作用及机制研究

作　者: 时丽丽
导　师: 杜冠华
学　校: 北京协和医学院
专　业: 药理学
关键词: 天然产物丹酚酸A 黄连碱小檗碱胰岛素抵抗罗格列酮二甲双胍糖尿病线粒体 AMPK PGC-1α Sirt3 F0F1-ATPase PI3K ROS 匹诺塞林脑缺血神经保护
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本论文以新药发现为核心,开展了两方面的研究：一、丹酚酸A等天然产物对糖代谢的影响；二、匹诺塞林对脑缺血的保护作用。通过对本课题的研究,为新型抗糖尿病及血管性药物的研发提供了实验依据。第一部分黄连碱、丹酚酸A等对糖尿病的防治作用研究糖尿病是一组以胰岛素绝对或相对缺乏为基本病理生理改变,以高血糖为主要临床特征的慢性内分泌代谢性疾病。近年来,其发病率逐年递增,已经成为严重影响人们生活质量和预期寿命的常见病。在糖尿病患者中,90%以上为2型糖尿病。胰岛素抵抗参与了2型糖尿病的发生、发展全过程。因此,降低血糖和改善胰岛素抵抗是防治糖尿病及其并发症的基础。黄连碱是中药黄连的主要化学成分之一,是小檗碱的同系物。已有研究证明,小檗碱具有广谱抗菌活性。目前已经证明小檗碱具有降血糖、调节血脂的药理作用,在临床上,已与其它治疗糖尿病的药物联合应用于治疗糖尿病。但一直未见黄连碱在调节糖代谢方面的药理研究。本实验对黄连碱调节糖代谢方面的作用进行了研究,同时与小檗碱的药效进行了比较。丹酚酸A是传统中药丹参中的水溶性化学成分之一,已有研究证明,丹酚酸A具有多方面的药理活性如：抗氧化、血栓形成抑制、心脑血管损伤保护、抗肝损伤及肝纤维化、抗肿瘤等作用。本课题的前期研究发现丹酚酸A能有效降低糖尿病动物模型的血糖,改善糖尿病合并肾病、肝纤维化病变及糖尿病大血管并发症病变,对糖尿病胰岛素抵抗可能也有改善作用。本实验探讨了丹酚酸A对2型糖尿病胰岛素抵抗的防治作用和作用机制,并同时与黄连碱、小檗碱的作用及作用机制进行了比较,为发现新型的同时具有降糖、治疗糖尿病并发症,改善胰岛素抵抗的药物奠定了实验基础。一、黄连碱对动物糖代谢的影响本课题评价了黄连碱对动物糖代谢的影响。本研究采用ICR小鼠评价了药物对正常动物糖代谢的影响(分正常组,黄连碱-10、30、100mg/kg3个剂量组及格列本脲-2.5mg/kg组)。并采用四氧啼啶诱导的糖尿病小鼠模型,评价了黄连碱对糖尿病动物糖代谢的影响(分模型组,黄连碱5、15、50、150mg/kg4个剂量组及二甲双胍-200mg/kg组)。结果表明(1)正常ICR小鼠口服给药3天,黄连碱-10mg/kg剂量明显降低小鼠的禁食血糖,随着给药时间的延长(给药6、10天),黄连碱-10、30 mg/kg剂量表现出显著效果,高剂量未见明显作用；对于非禁食血糖,黄连碱在给药第10天,低剂量才表现出显著降糖效果,且低剂量降糖效果强于中、高剂量。(2)四氧嘧啶糖尿病小鼠实验结果表明,黄连碱可降低小鼠的禁食血糖和非禁食血糖,改善糖耐量,减少小鼠24 h进水/进食量,以黄连碱-50mg/kg作用效果最好。综合两种动物模型的药效学实验结果,黄连碱具有明确的降糖作用,但降糖作用弱于格列本脲-2.5mg/kg和二甲双胍-200mg/kg。二、黄连碱对细胞糖代谢的影响及机制研究在明确黄连碱体内降糖作用后,本实验以人肝癌细胞株HepG2细胞和大鼠骨骼肌成肌L6细胞为研究对象,以小檗碱作为对照,评价了黄连碱对细胞糖代谢和线粒体功能的影响。实验结果表明：(1)黄连碱作用于L6细胞30 min,10-9-10-5M各浓度均可明显促进细胞葡萄糖摄取；(2)黄连碱10-5、10-4 M与HepG细胞、L6细胞共孵育12 h,细胞对葡萄糖的代谢量可明显增加,其作用随着作用时间的延长而增强,黄连碱10-6M以下浓度随时间延长也表现出促进细胞葡萄糖消耗作用。在10-5、10-4M浓度下,黄连碱对细胞糖代谢的促进率比insulin(3×10-8M)高,但略低于小檗碱(10-5M)；(3)药物与HepG2细胞孵育,从10min～24h不同时间点检测细胞内ATP的含量。结果显示黄连碱10-4M在1-24 h中均可可明显促进HepG2细胞ATP生成,而黄连碱10-9-10-5M则在孵育至24 h时表现出明显作用：小檗碱对细胞ATP生成无明显影响；二甲双胍与细胞孵育24 h可明显提高细胞内ATP含量；与L6细胞孵育,黄连碱104 M在6h时可提高ATP含量,其它浓度均未见明显作用,小檗碱与L6细胞作用1-6h均可明显抑制ATP生成,二甲双胍无明显作用。(4)与HepG2细胞孵育30 min,小檗碱和黄连碱均降低线粒体膜电位；(5)与肝脏/骨骼肌线粒体孵育10 min,黄连碱10-5M可降低肝脏线粒体呼吸链Ⅰ的V3、V4、RCR、OPR,升高ADP/O,同时降低骨骼肌线粒体呼吸链Ⅰ的V3、RCR、OPR;黄连碱对肝脏线粒体呼吸链Ⅱ呼吸功能影响不显著；(6)与肝脏线粒体孵育10 min,黄连碱10-5、10-4M可促进F0F1-ATPase舌性；(7)与肝脏线粒体孵育10 min,在底物刺激下黄连碱可促进线粒体ATP生成,提高ATP含量。综合上述实验结果,黄连碱能促进细胞葡萄糖转运、利用,其体外实验有效浓度在10-6～10-4M之间,作用强度略低于小檗碱。作用机制研究显示,黄连碱可能通过抑制线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的功能,降低线粒体膜电位,而发挥降糖作用,与小檗碱的降糖作用机制类似。但是,黄连碱可通过促进线粒体氧化磷酸化效率,促进ATP生成,进而促进糖代谢,这是不同于小檗碱的作用机制。三、丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗的作用本研究以自发性2型糖尿病胰岛素抵抗KKay小鼠模型为研究对象,连续给予丹酚酸A(分0.3、1.0、3mg/kg)、黄连碱-100ng/kg和小檗碱-100mg/kg9周,评价这些化合物对小鼠糖尿病模型胰岛素抵抗改善的作用,同时在细胞水平评价了药物对胰岛素协同的作用。实验结果表明：(1)KKay小鼠经过自然病程16周,出现胰岛素抵抗；(2)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱口服给药均可改善口服葡萄糖耐量,丹酚酸A药效强于后两者；(3)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均改善胰岛素耐量,丹酚酸A效果优于后两者；(4)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均降低小鼠禁食血糖、餐后血糖、果糖胺和HbAlc,丹酚酸A效果好于后两者；(5)丹酚酸A降低小鼠血浆中TG和LDL,对HDL和CHO无明显影响；黄连碱、小檗碱对小鼠血脂无明显影响。(6)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均降低小鼠24 h进食／进水量,丹酚酸A作用强于后两者；(7)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱均可降低糖尿病小鼠体重。(8)丹酚酸A、黄连碱、小檗碱在HepG2细胞/L6细胞上与胰岛素有协同作用,丹酚酸A的效果弱于后两者。本研究结果显示,丹酚酸A可较好地改善KKay小鼠的胰岛素抵抗,黄连碱、小檗碱也有改善小鼠胰岛素抵抗的作用,但是效果低于丹酚酸A；在细胞水平上,黄连碱、小檗碱的作用效果强于丹酚酸A。四、丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗的机制本部分进一步研究了丹酚酸A、黄连碱、小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制,并进行了药物之间作用机制的对比。实验结果表明：(1)丹酚酸A通过多种机制改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性。分别为①调控线粒体功能,表现为促进线粒体复合物I.F0F1_ATPase、琥珀酸脱氢酶的活性,促进胰岛素抵抗L6细胞ATP的生成；②改善氧化应激状态,降低胰岛素抵抗L6细胞ROS的生成；③促进PI3K磷酸化,增加GLU4表达及转位,促进葡萄糖转运、利用：④调控AMPK-PGC-lα-Sirt3轴,促进线粒体生物合成,调节机体糖脂代谢；(2)黄连碱可促进线粒体F0F1_ATPase酶活性,促进胰岛素抵抗L6细胞ATP的生成,降低胰岛素抵抗L6细胞ROS的生成；激活AMPK,调节机体糖脂代谢(3)小檗碱可激活AMPK,调节机体糖脂代谢。实验结果提示,丹酚酸A、黄连碱、小檗碱改善IR的作用机制有共同的方面,也有不同之处。第二部分匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的促进作用匹诺塞林是一种广泛存在于蜂胶和植物中的黄酮类天然化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理作用,本部分对其脑缺血保护作用的机制进行了探讨。本实验利用大鼠全脑缺血模型(4-vessel occlusion,4-VO),评价了匹诺塞林在体内对4-VO大鼠脑线粒体功能的保护作用。结果表明：(1)匹诺塞林降低4-VO全脑缺血大鼠的神经学评分及神经病理分级,减轻神经元损伤；(2)匹诺塞林可明显提高4-VO大鼠脑线粒体的ADP/O比值、V3以及RCI、OPR等参数,保护线粒体结构完整性；(3)体外实验表明,匹诺塞林能显著提高分离的脑线粒体的ADP/O, V3、RCI、OPR,降低V4,保护线粒体结构完整性；(4)匹诺塞林在体外可促进脑线粒体ATP的生成,可促进SH-SY5Y细胞的ATP生成。本研究发现匹诺塞林对脑缺血具有保护作用,其机制可能是通过保护线粒体结构与功能的完整性,降低NADH呼吸链的电子漏流,提高氧化磷酸化效率,促进线粒体呼吸功能,提升线粒体ATP合成能力等实现的。综上所述,黄连碱有降低正常小鼠及四氧嘧啶小鼠血糖的作用,可在细胞水平上促进细胞葡萄糖转运利用,但是效果弱于小檗碱。在改善胰岛素抵抗方面,丹酚酸A改善体内胰岛素抵抗的效果强于黄连碱、小檗碱,但是在细胞水平上,黄连碱、小檗碱的效果却优于丹酚酸A,三者改善胰岛素抵抗的机制相似,但不完全相同。本研究还发现匹诺塞林可通过保护线粒体结构、促进线粒体活性达到保护脑缺血的作用。

全文目录

中文摘要  9-13
Abstract  13-17
第一章黄连碱对体内糖代谢的影响  17-37
  前言  17-18
  第一节黄连碱对正常ICR小鼠糖代谢的影响  18-23
    1. 实验材料  18
    2. 实验方法  18-19
    3. 实验结果  19-23
      3.1 黄连碱对正常ICR小鼠降糖作用的评价  19-21
      3.2 黄连碱对正常ICR小鼠体重和肝脏系数的影响  21
      3.3 黄连碱对正常ICR小鼠24 h进水/进食量的影响  21-23
    4. 讨论  23
  第二节黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠的降糖作用评价  23-37
    1. 实验材料  23-24
    2. 实验方法  24-25
    3. 实验结果  25-32
      3.1 黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠降糖作用  25-27
      3.2 黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠葡萄糖耐量的影响  27-28
      3.3 黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠体重、肝脏系数的影响  28-30
      3.4 黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠24 h进食/进水量的影响  30-32
      3.5 黄连碱对四氧嘧啶诱导高血糖小鼠血浆内的TG,TC,LDL的影响  32
    4. 讨论  32-33
    5. 本章小结  33-34
    参考文献  34-37
第二章黄连碱对细胞糖代谢的影响及机制探讨  37-66
  前言  37-38
  第一节黄连碱对细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的影响  38-48
    1. 实验材料  38-40
    2. 实验方法  40-41
    3. 实验结果  41-46
      3.1 黄连碱对HepG2细胞活力及糖代谢的影响  41-43
      3.2 黄连碱对L6细胞活力及糖代谢的影响  43-46
    4. 讨论  46
    5. 小结  46-48
  第二节黄连碱对线粒体功能的影响  48-66
    1. 实验材料  48-49
    2. 实验方法  49-51
    3. 实验结果  51-60
      3.1 黄连碱对细胞ATP生成的影响  51-53
      3.2 黄连碱对HepG2细胞线粒体膜电位的影响  53-54
      3.3 黄连碱对线粒体呼吸功能的影响  54-58
        3.3.1 黄连碱对肝脏线粒体呼吸功能的影响  54-57
        3.3.2 黄连碱对骨骼肌线粒体呼吸功能的影响  57-58
      3.4 黄连碱对肝脏线粒体F_0F_1-ATPase的影响  58-59
      3.5 黄连碱对线粒体ATP含量的影响  59-60
    4. 讨论  60-62
    5. 小结  62
    参考文献  62-66
第三章丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗的作用  66-108
  前言  66-67
  第一节丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠胰岛素抵抗的作用  67-92
    1. 实验材料  67-68
    2. 实验方法  68-70
    3. 实验结果  70-88
      3.1 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠葡萄糖耐量的影响  70-74
      3.2 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠胰岛素耐量的影响  74-77
      3.3 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠血糖的影响  77-82
      3.4 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠血浆中血脂的影响  82-86
      3.5 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠体重的影响  86-87
      3.6 丹酚酸A、黄连碱等对KKay小鼠24 h进食/进水量的影响  87-88
    4. 讨论  88-92
  第二节黄连碱对细胞糖代谢的影响  92-96
    1. 实验材料  92
    2. 实验方法  92-93
    3. 结果  93-96
      3.1 黄连碱对HepG2细胞胰岛素协同作用的影响  93-94
      3.2 黄连碱对L6细胞胰岛素协同作用的影响  94-96
    4. 小结  96
  第三节丹酚酸A对细胞糖代谢的影响  96-103
    1. 实验材料  96
    2. 实验方法  96-97
    3. 实验结果  97-102
      3.1 丹酚酸A对HepG2细胞活力及葡萄糖消耗的影响  97-98
      3.2 丹酚酸A对L6细胞活力及葡萄糖消耗的影响  98-100
      3.3 丹酚酸A对HepG2细胞/L6细胞胰岛素协同作用的影响  100-102
    4. 讨论  102-103
  参考文献  103-108
第四章丹酚酸A、黄连碱改善胰岛素抵抗机制研究  108-140
  第一节丹酚酸A、黄连碱对线粒体作用探讨  109-120
    1. 实验材料  109-110
    2. 实验方法  110-112
    3. 实验结果  112-117
      3.1 丹酚酸A对大鼠肝脏线粒体复合物Ⅰ的影响  112-113
      3.2 丹酚酸A、黄连碱等对大鼠肝脏线粒体F_0F_1-ATPase的影响  113
      3.3 丹酚酸A、黄连碱等对大鼠肝脏/骨骼肌线粒体琥珀酸脱氢酶的影响  113-116
      3.5 丹酚酸A、黄连碱等对胰岛素抵抗L6细胞ROS产生的影响  116
      3.6 丹酚酸A、黄连碱等对胰岛素抵抗L6细胞葡萄糖摄取的影响  116-117
    4. 讨论  117-120
  第二节丹酚酸A、黄连碱等对胰岛素抵抗L6细胞信号通路的影响  120-132
    1. 实验材料  120-123
    2. 实验方法  123-125
    3. 实验结果  125-129
      3.1 丹酚酸A、黄连碱对等对PI3K信号通路的影响  125-126
      3.2 丹酚酸A、黄连碱等对AMPK信号通路的影响  126-127
      3.3 丹酚酸A、黄连碱等对PGC-1α信号通路的影响  127-128
      3.4 丹酚酸A、黄连碱等对Sirt3表达量的影响  128-129
    4. 讨论  129-132
  第三节丹酚酸A、黄连碱等改善胰岛素抵抗作用机制的讨论  132-134
  参考文献  134-140
第五章匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的促进作用  140-156
  前言  140
  1. 实验材料  140-141
  2. 实验方法  141-144
  3. 实验结果  144-151
    3.1 匹诺塞林对4-VO大鼠脑卒中指数的影响  144
    3.2 匹诺塞林对4-VO大鼠脑海马CA1区神经元的影响  144-146
    3.3 匹诺塞林对4-VO大鼠脑线粒体呼吸功能的影响  146-147
    3.4 匹诺塞林对正常大鼠脑线粒体呼吸功能的影响  147-149
    3.5 匹诺塞林对ATP生成的影响  149-150
    3.6 匹诺塞林对正常大鼠脑线粒体膜电位的影响  150-151
  4. 讨论  151-152
  参考文献  152-156
第六章全文总结  156-161
  一丹酚酸A、黄连碱等对糖尿病防治作用及其比较  156-160
  二匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的促进作用  160
  三本文创新之处  160
  四本文不足之处  160-161
综述:线粒体功能损伤与胰岛素抵抗  161-170
  Reference  165-170
线粒体功能障碍与双相障碍  170-173
个人简历  173-174
致谢  174-176

丹酚酸A、黄连碱对糖代谢的作用及机制研究

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