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自体移植冻存猪骨髓内皮祖细胞防治多器官功能障碍的研究

作　者: 吴建国
导　师: 方国恩；毕建威
学　校: 第二军医大学
专　业: 外科学
关键词: 内皮祖细胞多器官功能障碍细胞冻存自体移植体外培养
分类号: R459.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)是临床危急重患者死亡的主要原因之一,目前已成为ICU的首要死亡原因(占50% - 80%)。尽管近年来对MODS研究取得了不错的进展,但其病死率仍居高不下。因此,如何防治MODS仍是临床医学面临的一个难题。目前MODS发病机制尚不完全明确,临床上仍缺乏理想的预防和治疗措施。随着干/祖细胞对器官组织缺血损伤修复研究的不断深入,多器官功能障碍综合征的发病机制和临床治疗的探索面临着新的契机。有研究表明,机体损伤后血循环中具有多向分化潜能的祖细胞一方面可以在某些细胞因子作用下动员、增殖、迁徙入损伤器官,分化为相应的内皮细胞进行损伤修复;另一方面内皮细胞不仅是炎症反应的参与者,还是首先受损的靶细胞,并进而造成微血管损伤、微循环障碍,这可能是器官功能障碍的始发环节。大量的动物和临床实验都已经证明:当组织受到损伤时,尤其是缺血性损伤时,循环及组织中内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)动员增加,并向缺血组织迁徙,粘附,并促使其增殖。还可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修复裸露的血管内皮损伤区,参与缺血或损伤组织内新生血管的形成,从而改善损伤器官的缺血状态,逐步恢复功能。而创伤进一步加重时,会使EPCs的分化、迁徙等功能发生严重障碍,导致微循环严重损害而无法得到修复,最终发生器官功能衰竭,甚至死亡。近年来的大量研究[4]显示,EPCs在心脑血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用。且临床上通过移植EPCs治疗缺血性疾病获得成功,具有广阔的应用前景。但是无论从骨髓、脐血、胚胎肝和外周血中分离培养出EPCs数量都非常有限,不能满足实验研究及临床应用的需要,这是目前限制EPCs广泛应用的一个主要原因。而且在发生感染、休克及器官功能障碍时血循环中EPCs的数量和功能会相应减少,这些病人移植EPCs产生治疗作用可能需要的数量更多。目前干细胞在临床的广泛应用大部分通过低温保存的方法得以实施,这种保存方法可基本保存细胞的特征和功能,数量也无明显变化,无明显的毒副作用。但至今有关EPCs冻存的研究甚少,关于低温冻存后EPCs的移植研究尚未报道。在前期罗天航等博士证实在MODS发生前EPCs数量和功能明显下调及EPCs移植可较好的防治猪MODS发生的基础上,本研究将EPCs进行体外扩增后低温冻存,并将冻存后的EPCs回输,观察移植后的疗效及安全性。为EPCs的进一步实验研究及临床应用奠定基础。本研究共分为三部分,首先建立起小型猪MODS的动物模型;其次从猪骨髓分离出单个核细胞,培养扩增至第四代EPCs,然后低温冻存,在移植前复苏培养;复苏后行鉴定及其增殖、迁移、粘附及成血管等功能检测;最后将冻存的细胞移植入猪体内,观察EPCs分布情况及移植后MODS的发生率和重要脏器的功能改善情况,评价移植冻存EPCs防治MODS的效果,并观察移植后实验动物的生存率及生存时间,对其安全性进行初步评价,并初步探讨其作用机制。全文共分三个部分:第一部分小型猪多器官功能障碍模型的建立目的:建立标准的“二次打击”小型猪MODS模型,为研究移植冻存的EPCs防治创伤后MODS提供实验基础。方法:将体重25.22±3.17 Kg健康小型猪20只随机分为2组:实验组(M组)10只,施行失血性休克+内毒素血症复合因素;对照组(C组)10只,施行假手术,予以股动静脉置管,不实施失血及内毒素注射。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、PaO2,以判断器官功能,并观察主要脏器的大体及镜下病理改变,行对照研究。结果:实验组WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明显升高, PaO2明显下降。心、肺、肝、肾和胃肠道均呈现非特异性的炎性改变。实验组和对照组MODS发生率为(80%,0),死亡率为(70%,10%),实验组显著高于对照组(P﹤0.017)。结论:本实验采用二次打击方法,操作简单,容易复制,且MODS的发生率较高,模型成熟稳定,是一个理想的动物模型。第二部分冻存和新鲜猪骨髓来源内皮祖细胞的功能特征比较目的:证实体外扩增的猪骨髓来源EPCs经低温冻存后其表型、功能特征和细胞数量基本无变化,为冻存EPCs移植防治MODS奠定基础。方法:从猪骨髓分离出单个核细胞,行诱导分化培养,培养至P4代细胞行低温冻存,观察新鲜及冻存EPCs的生长情况,并通过细胞形态和超微结构、免疫组化、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管生成功能等方法对其鉴定,并行对照分析。结果: EPCs冻存后细胞形态无变化,活细胞率超过90%。新鲜和冻存细胞鉴定如下:电镜下观察细胞内均可见到典型的Weibel-Palade小体;吞噬功能:贴壁细胞Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1摄取率超过88%;免疫组化:CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++),CD133(+)、CD34(++)、CD31(+++)、KDR(+++);流式细胞仪技术:CD133的阳性率:17.24±2.87%、3.93±0.74%,CD34的阳性率:37.21±9.32 %、35.71±7.35 %,CD31的阳性率:72.07±14.14%、72.23±16.69%,KDR的阳性率:89.09±15.06%、87.28±17.34%;体外血管生成功能:25.42±4.38个/HP、23.79±3.54个/HP;粘附功能:贴壁率为42.7±2.1%、39.5±1.7%;迁徙功能:迁徙率为15±0.71%、14.2±0.63%;增殖功能:8天增殖细胞数是25.06±2.82×10~4、21.64±2.34×10~4;NO含量:83.21±3.54umol/L、81.59±3.17 umol/L。结论:体外培养的EPCs经低温保存后其细胞形态、活力及功能特征无明显差别,可将体外扩增的细胞低温冻存,移植前可获取大量细胞,保证移植效果。第三部分:移植冻存的猪骨髓内皮祖细胞防治多器官功能障碍的研究目的:初步评价移植冻存的猪骨髓来源EPCs对猪创伤后多器官功能障碍综合症防治的有效性和安全性。方法:细胞移植剂量:实验动物(n=21)按不同移植剂量随机分为3组: 1×105个/Kg(A组),1×10~6个/Kg(B组),1×10~7个/Kg(C组)。细胞移植时间:实验动物(n=21)按不同时间点随机分为3组: T2维持失血性休克状态2h(A组),T3输大肠杆菌脂多糖后1h(B组),T4输大肠杆菌脂多糖后12h(C组)。冻存细胞移植:实验动物(n=21)随机分为3组:等量的PBS(A组),新鲜EPCs移植(B组),冻存EPCs移植(C组)。对比不同实验组的EPCs进行移植治疗后动物MODS的发生率及生存率。结果:细胞移植剂量:A组、B组、C组MODS的发生率为71.43%、42.86%、42.86% (P < 0.017),生存率为28.71%、57.14 %、42.86% (P < 0.017)。细胞移植时间:A组、B组、C组MODS的发生率为57.14%、42.86%、71.43% (P < 0.017),生存率为42.86%、57.14 %、14.29% (P < 0.017)。冻存细胞移植:A组、B组、C组MODS的发生率为85.71%、42.86%、42.86% (P < 0.017),生存率为14.29%、57.14 %、57.14 % (P < 0.017)。结论:移植猪骨髓来源EPCs防治MODS,合适的移植剂量是1×10~6个/Kg,最佳的移植时间是T3,在T3按1×10~6个/Kg剂量移植冻存的和新鲜的EPCs均有疗效,两者间在疗效及安全性上无明显差别。小结:机体发生炎症的创伤时,体内EPCs的数量减少及功能障碍可能是MODS发生发展的重要原因之一,移植的内皮祖细胞可以在机体发生MODS后向不同组织迁徙或归巢,对微循环具有重要的修复及血管新生作用,以改善创伤后缺血缺氧引起的脏器功能障碍。内皮祖细胞可在体外大量扩增并行低温保存,且低温保存后细胞的功能特点基本无变化,可争取在MODS发生前获得充足的细胞,保证细胞移植的效果;可较好的防止MODS的发生和发展,同时可改善MODS动物的预后以及延长生存时间。为在临床上应用EPCs移植防治MODS奠定基础。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-12
缩略词表  12-14
前言  14-16
第一部分小型猪多器官功能障碍动物模型的建立  16-36
  材料与方法  16-23
  结果  23-30
  讨论  30-34
  参考文献  34-36
第二部分冻存和新鲜猪骨髓来源内皮祖细胞的功能特征比较  36-65
  材料与方法  36-45
  结果  45-55
  讨论  55-62
  参考文献  62-65
第三部分自体移植冻存的猪骨髓来源内皮祖细胞防治创伤后多器官功能障碍的研究  65-104
  材料与方法  66-72
  结果  72-93
  讨论  93-101
  参考文献  101-104
全文总结  104-105
综述  105-112
  参考文献  109-112
在校期间学术成果  112-114
致谢  114

自体移植冻存猪骨髓内皮祖细胞防治多器官功能障碍的研究

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