学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

HGF基因促进内皮祖细胞增殖的体外研究

作　者: 李辰运
导　师: 陈剑秋
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肝细胞生长因子 血管内皮祖细胞 腺病毒转染 细胞培养 血管生成
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 11次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目的体外条件下从大鼠骨髓中分离出单个核细胞,使用专用的培养基使其向内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分化生长,并将HGF基因转染原代培养的大鼠血管内皮祖细胞,观察转染后细胞上清液中HGF的表达及HGF基因对原代培养血管内皮祖细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响。方法1.取4-6周龄Wistar大鼠(120-150g)双下肢股骨及胫骨骨髓,利用密度梯度离心法分离单个核细胞,并使用内皮系专用培养液EGM-2MV诱导培养,使其分化为血管内皮祖细胞。通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长情况,通过荧光显微镜观察细胞摄取DiL-acLDL,结合FITC-UEA-1,从功能角度鉴定细胞,并通过流式细胞术动态测定细胞表面抗原CD133、flk-1、VE-cadherin(CD144)及CD31进一步鉴定所培养细胞为血管内皮祖细胞。2.提取和扩增pCMV-HGF质粒,以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)为载体介导HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率；采用ELISA法检测转染后HGF蛋白的表达情况；用MTT法检测HGF基因对EPCs增殖的促进作用；Transwell检测细胞的迁移能力；3D培养法观察细胞体外血管形成能力。结果1.成功分离和培养出大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过细胞功能检测和流式细胞术检测表面抗原来鉴定。2.成功将HGF基因转染大鼠骨髓血管内皮祖细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达；在HGF转染组细胞培养上清中检测到HGF的表达,第1天、2天、4天、7天、11天浓度分别为22.15±3.77ng/ml、39.42±7.32ng/ml、99.09±9.89ng/ml、311.87±26.56 ng/ml、224.72±20.91ng/ml,而空载腺病毒组、阴性对照组没有检测出HGF的表达；转染后HGF基因对原代培养的血管内皮祖细胞生长有显著的促增殖作用,转染4天和7天,转染组血管内皮祖细胞增殖明显加快,与空载腺病毒组和阴性对照组相比均有统计学意义(P<0.05)；转染后细胞迁移能力增强；3D培养可见血管样结构形成。结论1.体外条件下能够从大鼠骨髓中成功分离出单个核细胞并诱导培养出血管内皮祖细胞。2.通过腺病毒介导,可成功的将HGF基因转染入大鼠血管内皮祖细胞,并且在培养上清液中可检测到HGF蛋白,证实转染后的目的基因能够在细胞中有效的表达并促进EPCs增殖、迁移及血管形成。为下一步利用该基因进行基因-干细胞移植治疗肢体缺血性疾病提供实验基础。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
符号说明  10-11
前言  11-17
  研究现状、结果  11-15
  研究目的、方法  15-17
第一部分 大鼠骨髓血管内皮祖细胞原代培养及鉴定  17-30
  1.1 对象和方法  17-22
    1.1.1 动物  17
    1.1.2 主要试剂  17-18
    1.1.3 主要仪器  18
    1.1.4 主要实验试剂的配制及稀释  18-19
    1.1.5 大鼠骨髓血管内皮祖细胞的体外培养  19-21
    1.1.6 细胞染色与鉴定  21-22
    1.1.7 流式细胞仪动态检测内皮祖细胞表面标志  22
  1.2 结果  22-25
    1.2.1 血管内皮祖细胞的原代培养  22-23
    1.2.2 细胞染色与鉴定  23
    1.2.3 内皮祖细胞表面标志的动态变化  23-25
  1.3 讨论  25-29
    1.3.1 内皮祖细胞的来源  25-26
    1.3.2 内皮祖细胞的分离和培养  26-28
    1.3.3 内皮祖细胞的表型及鉴定  28-29
  1.4 小结  29-30
第二部分 腺病毒载体介导HGF基因转染内皮祖细胞及对其增殖的影响  30-48
  2.1 对象和方法  30-40
    2.1.1 主要试剂和仪器  31-33
    2.1.2 溶液的配制  33-34
    2.1.3 质粒的转化及提取  34-36
    2.1.4 腺病毒介导的HGF基因转染血管内皮祖细胞  36-37
    2.1.5 ELISA法检测转染后细胞HGF的表达  37-39
    2.1.6 MTT比色法检测转染后HGF对内皮祖细胞增殖的影响  39
    2.1.7 Transwell小室制备  39-40
    2.1.8 EPCs体外血管形成3D培养  40
    2.1.9 统计学处理  40
  2.2 结果  40-44
    2.2.1 质粒的转化  40
    2.2.2 质粒小量提取  40-41
    2.2.3 酶切鉴定pCMV-HGF和pcDNA3质粒  41
    2.2.4 质粒浓度及纯度测定  41
    2.2.5 细胞转染  41
    2.2.6 转染后上清液中HGF的含量  41-43
    2.2.7 转染后内皮祖细胞的增殖  43-44
    2.2.8 转染后EPCs的迁移能力  44
    2.2.9 转染后EPCs血管形成能力  44
  2.3 讨论  44-47
  2.4小结  47-48
结论  48-49
参考文献  49-56
发表论文和参加科研情况说明  56-57
附录  57-59
综述 血管内皮祖细胞研究进展  59-65
  综述参考文献  62-65
致谢  65

相似论文

  1. 血管生成调节因子对性成熟前小鼠卵泡及其血管发育的影响,S865.13
  2. 血管生成调节因子对性成熟小鼠卵泡及其血管发育的影响,S852.2
  3. 树突状细胞在多柔比星诱导的大鼠肾纤维化模型中的作用,R692.5
  4. 纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架材料复合大鼠成骨细胞培养的实验研究,R318.08
  5. Angiopoietin-1对高糖培养内皮细胞血管生成调控因子表达的影响,R587.2
  6. 人瘢痕疙瘩成纤维样（间充质）干细胞生物学特性鉴定,R622
  7. 大鼠颅内外动脉血管平滑肌细胞的体外培养与鉴定,R743.3
  8. 兔脂肪来源干细胞分离培养及富血小板血浆对其增殖的影响,R329
  9. 人皮肤成纤维细胞搅拌培养和保存的初步研究,R329
  10. 常规化疗联合节拍化疗对乳腺癌裸鼠移植瘤的实验研究,R737.9
  11. Angiopoietin-1对高糖培养内皮细胞连接相关蛋白的影响,R363
  12. 低浓度血清法培养纯化新生大鼠雪旺细胞,R329
  13. 环磷酰胺LDM联合MTD在乳腺癌抗血管生成、诱导凋亡方面的研究,R737.9
  14. MTD化疗联合节律化疗对乳腺癌血管生成和细胞增殖的研究,R737.9
  15. 普萘洛尔对体外培养婴幼儿血管瘤内皮细胞VEGF、MMP-2的影响及意义,R739.5
  16. 虎纹捕鸟蛛粗毒对人结肠癌SW480细胞体外增殖的影响,R735.35
  17. 丝素微球的制备及其作为细胞载体的研究,R318.08
  18. 不同葡萄糖浓度对乳鼠心肌细胞培养中自噬的影响,R542.2
  19. IGFBP-6对缺氧诱导性血管生成的作用研究,Q46
  20. TLR2在皮肤癣菌感染中对角质形成细胞分泌γ-IFN和IL-8的影响,R756
  21. 超声造影对肝脏肿瘤病变的诊断及评估肝脏恶性肿瘤造影模式与其血管生成的关系,R735.7

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
© 2012 www.xueweilunwen.com