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血小板第4因子对人骨髓基质细胞的辐射保护作用及机制研究

作　者: 陈娟娟
导　师: 杨岚；田琼
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学
关键词: 血小板第4因子电离辐射骨髓基质细胞细胞周期细胞凋亡 p21蛋白增殖细胞核抗原细胞色素P450 1A1
分类号: R818
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景和目的电离辐射（ionizing radiation, IR）后组织器官修复主要取决于干细胞的增殖能力。无论是来自表皮还是血液的干细胞都聚集于造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment, HIM）内,通过HIM迁移到远处发挥作用。HIM中的基质细胞不仅对维持干细胞增殖能力有利,还能保持其旁观者效应,使得绝大多数造血干细胞维持在非细胞周期增殖状态,从而避免了电离辐射直接诱导的细胞凋亡和其产生细胞因子、自由基等所致的间接杀伤。骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）是HIM的重要组成成分。它通过与造血细胞密切接触、分泌细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和多种细胞因子调节造血,其结构和功能的完整对于保持机体在生理状态尤其是应激状态下造血稳定具有十分重要的作用。血小板第4因子（platelet factor 4, PF4）是一个潜在的辐射保护趋化因子,它能可逆性的抑制造血干/祖细胞增殖、促进造血干/祖细胞与内皮细胞和间质的黏附和活性、在干细胞移植中促进循环干细胞归巢到骨髓、减弱骨髓细胞对化疗药的化学敏感性并提高化疗后造血祖细胞的活力和生存率、加速全身照射后小鼠造血恢复、抑制辐射所致小鼠骨髓细胞的凋亡、保护小鼠造血细胞免受辐射损伤。实验方法和结果本课题研究了PF4对急性辐射损伤的人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）的保护作用,旨在探讨PF4的辐射防护机制,为寻找可应用于临床的新型辐射保护剂奠定基础。实验将原代培养的hBMSCs随机分为4组:①PF4 +照射组（P + I）,②P F4保护组（P）,③单纯照射组（I）,④正常对照组（N）。照射前给予1μg·ml-1 PF4或等量PBS预孵育12 h,然后予以或不予以5.0 Gy吸收剂量的60Co-γ射线均匀照射,辐照后设置时间点收集各组细胞进行研究,具体为:1、甲基噻唑基四唑法（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）测定照后d0～d10细胞活性以确定PF4最佳给药时间和最佳起效剂量以及最佳电离辐射吸收剂量;2、荧光共聚焦显微镜动态观察各处理组细胞的生长状态、生长规律和表观特性;3、流式细胞术检测辐照后20h细胞周期;4、磷脂酰丝氨酸外翻分析法检测辐照后d2、d4、d6细胞凋亡;5、实时逆转录多聚酶链反应法（realtime reverse transcription polymerase chain reaction , RT-PCR）测定辐照后20h p21、CYP1A1、PCNA mRNA表达水平。结果发现:1、PF4对人正常骨髓基质细胞生长无明显抑制或促进作用。2、与I组相比,PF4明显提高5.0 Gy⁶⁰Co-γ射线照射后hBMSCs存活率,存活细胞达60 %以上（I组<40 %）。3、受辐照组细胞增殖缓慢,约于照后d 4进入对数生长期,与I组比较,P+I组细胞体积大、边界清、轮廓完整、胞内分泌颗粒相对较少、碎裂细胞少、呈现典型的成纤维细胞特有的纺锤形、条索状、漩涡样排列,同时细胞存活时间（2.5个月）和传代次数（4～5）明显增加,I组仅为1.5个月和1～2次。4、I组G0/G1期细胞比例显著高于N组和P组,相差约（20～40）%;与N组和I组相比,使用PF4的实验组S期比例显著增高有统计学意义（P<0.01）;P组与P+I组相比无统计学差异。5、细胞凋亡结果显示,辐照因素对hBMSCs的影响从第2天已开始,活细胞减少（91.500±0.819 %）、晚期凋亡细胞增多（3.567±0.551 %）,后期早期凋亡细胞（17.133±2.854 %）异常增多;PF4对hBMSCs的保护作用在辐照早期不甚明显,仅早期凋亡细胞减少（2.233±0.208 %）、活细胞增多（93.033±0.379 %）,从第4天以后该优势表现得更为明显（P<0.001）,到第6天时P+I组的各组细胞与N组和P组相差无异,而单纯照射组细胞损伤巨大。4、realtime RT-PCR结果显示,照射引起hBMSCs p21 mRNA表达上调,I组（ + 0.84±0.03）p21 mRNA表达较之N组（0.000±0.000）显著上调（P<0.01）;与I组相比,P组（ + 0.170±0.090）p21 mRNA表达下调（P<0.05）;P+（I + 0.420±0.210）组较之I组p21 mRNA表达下调;其余各组间差异无统计学意义。PF4能诱导CYP1A1 mRNA表达下调,与I组（ + 0.201±0.091）相比,P组（﹣0.221±0.084）和P+I组（﹣0.502±0.060）CYP1A1 mRNA表达明显下调（P<0.01）;当有照射因素参与时,含PF4的实验组hBMSCs CYP1A1 mRNA表达的下调更显著。结论1、60Co-γ射线造成hBMSCs细胞损伤的最佳吸收剂量为5.0Gy;PF4对hBMSCs的最佳给药时间为照射前12h,最佳起效剂量为1μg·ml^-1。2、PF4对人正常骨髓基质细胞生长无明显抑制或促进作用。3、PF4具有减轻电离辐射对hBMSCs损伤的保护作用,该作用呈现出剂量依赖性和可逆性,无时间依赖性,具体表现为抑制细胞凋亡、增加存活细胞比例、提高细胞活力、保持细胞正常形态、促进电离辐射急性抑制期后细胞增殖的恢复、维持恢复期细胞增殖分化和传代能力。4、PF4能将细胞静止于细胞周期S期,其调控机理可能与其特异性调节p21 mRNA和CYP1A1 mRNA表达有关,它们参与了细胞内的一系列信号转导通路并能产生相应的生理效应。

全文目录

缩略语表  6-10
中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
前言  17-19
文献回顾  19-38
  一、血小板 4 因子的基本结构和生物学特性  19-26
  二、血小板 4 因子的对造血细胞的作用及机理  26-31
  三、血小板 4 因子的辐射防护作用及机理  31-35
  四、血小板 4 因子的化疗保护作用及机理  35-38
引言  38-39
实验材料  39-42
  1 主要试剂  39-40
  2 主要仪器  40
  3 常用缓冲液及培养基  40-42
实验方法  42-51
  1 hBMSCs 培养  42-44
    1.1 原代hBMSCs 来源  42
    1.2 密度梯度离心法提取hBMSCs  42-43
    1.3 形态学鉴别hBMSCs  43-44
  2 实验分组  44
  3 MTT 法检测PF4 最佳给药时间、最佳给药浓度和最佳辐射剂量  44-45
    3.1 MTT 法检测最佳给药浓度  44
    3.2 MTT 法检测PF4 最佳给药时间  44
    3.3 MTT 法检测最佳辐射剂量  44-45
  4 流式细胞仪分析细胞周期  45-46
  5 流式细胞仪磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡  46-47
  6 RT-PCR 检测人P21、CYP1A1 和PCNA mRNA 的表达  47-51
    6.1 引物设计  47-48
    6.2 RNA 提取  48-49
    6.3 反转录  49-50
    6.4 realtime RT-PCR 反应  50-51
实验结果  51-59
  1 PF4 对hBMSCs 细胞活力的影响  51-53
    1.1 不同给药浓度对hBMSCs 细胞活力的影响  51-52
    1.2 不同给药时间对hBMSCs 细胞活力的影响  52-53
    1.3 不同照射剂量对hBMSCs 细胞活力的影响  53
  2 PF4 对hBMSCs 形态的影响  53-54
  3 PF4 对hBMSCs 细胞周期的影响  54-55
  4 PF4 对hBMSCs 细胞凋亡的影响  55-57
    4.1 照后d 2 hBMSCs 细胞凋亡  55-56
    4.2 照后d 4 hBMSCs 细胞凋亡  56-57
    4.3 照后d 6 hBMSCs 细胞凋亡  57
  5 PF4 对hBMSCs p21、CYP1A1 和PCNA mRNA 表达的影响  57-59
    5.1 PF4 对hBMSCs p21 m RNA 表达的影响  57-58
    5.2 PF4 对hBMSCs CYP1A1 mRNA 表达的影响  58-59
    5.3 PF4 对hBMSCs PCNA mRNA 表达的影响  59
统计及处理  59
分析和讨论  59-65
小结  65-66
参考文献  66-77
个人简历和研究成果  77-78
致谢  78

血小板第4因子对人骨髓基质细胞的辐射保护作用及机制研究

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