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背景和目的血管性痴呆是指脑血管疾病所致,以学习记忆减退为主要临床表现的慢性获得性严重认知功能障碍综合征,为脑血管疾病常见后遗症。目前认为细胞凋亡是血管性痴呆的发病机制之一。海马是与学习记忆功能有关的主要脑功能区,易被缺血损伤。研究认为慢性脑缺血可引起海马的细胞凋亡,变性,萎缩,损伤后常常引起学习、记忆功能障的出现,为血管性痴呆的病理基础。iNOS为诱导型一氧化氮合成酶。p38MAPK是p38MAPK信号传递通路的主要成员。多数研究发现,iNOS和p38MAPK在急性性脑缺血组织中通过细胞凋亡参与了脑组织的损伤过程。丁苯酞是我国自行研制的国家一类治疗非出血性卒中的新生代抗脑缺血药物。它不仅可从重新构建缺血组织区域供血路径对缺血脑组织达到保护,而且可从给予线粒体保护,减少钙库释放钙离子等多个环节抵抗细胞凋亡,从而起到抵御脑缺血损伤作用,使脑神经功能达到复原,达到对临床症状减轻的目的。它对细胞凋亡虽有抵御作用,但细胞凋亡这一过程相当复杂,用它来对血管性痴呆学习记忆障碍治疗是否会产生效果,目前报道不多。我们拟采用血管性痴呆大鼠模型,以海马为研究部位,iNOS与p38MAPK表达情况、细胞凋亡情况及学习记忆能力为观察指标,观察它们在丁苯酞干预后的变化,以期为临床治疗血管性痴呆寻找新的药物并探讨血管性痴呆的具体分子机制。材料与方法1.实验动物的分组：把42只成年雄性Wistar大鼠随机等分为假手术组,模型组,丁苯酞组。2.实验动物模型的制作：用双颈总动脉永久结扎方法。三组大鼠均腹腔内注射麻醉,成功后沿颈部正中纵向切开皮肤,钝性分离开皮下筋膜及肌肉组织至双侧颈总动脉。模型组与丁苯酞组的大鼠,每侧颈总动脉用0号手术丝线进行双结扎,从中间剪断,缝合手术切口。术后保暖,待苏醒,放回清洁笼箱继续饲养。假手术组的大鼠除不做结扎外,亦按上述手术过程进行操作。3.试验给药剂量、方法及持续时间：术后2周,丁苯酞治疗组按65 mg／kg,给予灌胃,模型组与假手术组进行同样的过程,但没给药物。三组均每天一次,连续2月。4.大鼠学习记忆行为能力的测定：2月后用Y-型迷宫测试各组大鼠学习记忆能力,以大鼠受电击后直接跑到安全区为正确反应,以连续10次中出现9次正确反应前所需的电击次数代表大鼠学习能力。24小时后,每个大鼠测试10次,记下10次中出现的正确反应次数,以正确反应次数代表记忆能力。5.海马组织切片的制作：迷宫试验后,把海马组织从已排净血液的大脑中分离出来,放入到4%甲醛内并保持24h,然后常规脱水,透明,浸蜡,包埋,冠状方向切片(厚5μm)以备用。6.免疫组化及Tunel染色：按iNOS和p38MAPK免疫组化及Tunel试剂盒要求进行染色,并在400倍光学显微镜下观察。7.图像采集分析：用德国Lecia显微照像系统和Biosens Digital Imaging System v1.6在每个大鼠的每张切片上随机选取面积大致相同测3个视野,照相并测定灰度值,取平均值作为该切片结果,然后把所有切片结果再取平均值,均用均数±标准差(x±s)表示。8.数据统计学检验：用SPSS17.0统计软件,单因素方差分析,组间用LSD法,P<0.05有统计学意义。结果1.三组大鼠学习、记忆能力情况：三组大鼠中,以假手术组大鼠的学习速度最快,遗忘最少。学习时,连续10次中出现9次正确反应的这一结果出现前所需的电击次数最少,为34.07±3.09次；24小时后正确反应遗留了8.07±1.07次。而丁苯酞组较慢,学会要求所需的电击次数为60.78±4.26次,遗忘较多,遗留6.42±1.45次。模型组最慢.学会要求时所需的电击次数为74.21±3.0次,24小时后10次中正确反应次数遗留了4.64±1.49次。三组之间统计学比较有明显差异,P值均小于0.05。2.海马区iNOS免疫组化染色情况：iNOS免疫组化染色应该出现在细胞浆中,为不同程度的棕黄色。在假手术组中,光镜下仅见到极少量淡棕黄色的细胞；而在模型组可见深棕黄色,数目较多；丁苯酞组见到是棕黄色,数目较少。三组中阳性细胞区平均灰度值,丁苯酞组(72.51±4.80)大于假手术组的(7.07±2.33)低于模型组：72.51±4.80。与假手术及模型组比较,P<0.05。3.海马区p38MAPK免疫组化染色情况：p38MAPK染色出现在胞核中,染色程度只不过因p38MAPK含量的多少而不同。在假手术组中,光镜下仅见到少量浅棕黄色细胞；而在模型组见到多量深棕黄色细胞。在丁苯酞组,见到的阳性细胞是棕黄色,且数目相对模型组而言较少,而较假手术组多。三组中阳性细胞区平均灰度值,丁苯酞组的(65.02±4.14)大于假手术组的(10.20±2.32)低于模型组：70.72±4.81,与假手术及模型组比较P<0.05。4.海马区细胞凋亡Tunel染色情况：在假手术组中有少量细胞核被染成棕色的细胞存在,胞质浓缩,胞体减小,核碎裂散开。模型组出现这样的细胞明显增多。在丁苯酞组,这样的细胞同样被看到,但数目较模型组减少而多于假手术组。三组中细胞凋亡数目以模型组的最多,丁苯酞组的数目次之,在假手术组出现的数目最少。分别为(61.92±4.19)%；(35.00±3.32)%；(5.07±2.40)%,P<0.05。结论1.丁苯酞对血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍能够起到改善作用。2.iNOS和p38MAPK与血管性痴呆学习记忆障碍发生发展存在着一定关系。3.丁苯酞对血管性痴呆大鼠的学习、记忆的改善,可能是通过降低iNOS和p38MAPK的表达,阻断海马细胞凋亡的结果。
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