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经鼻给予转化生长因子-β1对氯化锂—匹罗卡品诱导的癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用

作　者: 李良勇
导　师: 王玉
学　校: 安徽医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 癫痫持续状态海马 TGFβ1 Fluoro-Jade B 鼻腔给药
分类号: R742.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:运用无创、简便有效的鼻腔给药方法,将TGFβ1直接递送到癫痫持续状态(SE)大鼠中枢神经系统并避开血脑屏障(BBB)的阻隔,探讨TGFβ1对氯化锂-匹罗卡品所致癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用及其潜在的机制。方法:健康雄性SD大鼠60只,随机分为TGF组、Pilo组和正常对照组(Control)。建立氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态(Lithium-Pilocarpine induced status epilepticus)模型。SE后50 min,注射地西泮10 mg/kg终止SE。正常对照组大鼠采用等量的0.9%氯化钠溶液替代匹罗卡品。TGF组大鼠经鼻给予重组人TGFβ1,同时Pilo组和Control组经鼻给予相同容量的生理盐水。SE后6 h、24 h、48 h和72 h,开胸灌注取脑行冠状切片。应用HE染色、TUNEL染色、Fluoro-Jade B (FJB)荧光染色法分别观察各组大鼠海马神经元的形态结构变化、原位凋亡及变性死亡情况。并采用免疫组化方法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Caspase-3的蛋白表达。结果:(1)正常对照组大鼠海马神经元排列整齐,胞浆透明,细胞核呈圆形或椭圆形,染色质分布均匀,核仁清晰;SE后6 h各组大鼠海马CA1、CA3及DG区部分细胞排列紊乱,胞体收缩呈三角形或极不规则,胞核固缩,结构不清;24 h后嗜伊红浓染显著,神经元坏死崩解逐渐增多;其中Pilo组SE后72 h达高峰。SE后24 h、48 h、72 h,TGF组海马神经元形态结构恶变数量、程度均较Pilo组减轻。(2)Fluoro-Jade B染色可特异性标记变性神经元,FJB阳性变性神经元呈亮黄绿色;Pilo组和TGF组大鼠海马均可见FJB阳性变性神经元,主要分布在海马DG和CA1区,CA3区亦可见少数FJB阳性细胞,FJB荧光染色可清晰地显示变性神经元的胞体和部分突起;正常对照组未见FJB阳性细胞。造模各组大鼠SE后6 h,DG和CA1区可见少量FJB阳性变性神经元,此后各组FJB阳性变性神经元明显增多,其中Pilo组72 h达高峰; SE后6 h,TGF组大鼠海马DG和CA1区FJB阳性变性神经元与Pilo组比较无统计学差异;SE后24 h、48 h、72 h,TGF组大鼠海马DG和CA1区FJB阳性变性神经元均较Pilo组显著减少(P < 0.05);其中72 h最为明显(P < 0.01)。(3)正常对照组大鼠海马未见TUNEL阳性细胞或仅有微量表达。Pilo组和TGF组大鼠海马均可见TUNEL阳性细胞,主要分布在海马CA1和CA3区; DG区亦可见少数TUNEL阳性细胞。SE后6 h各组大鼠海马可见少量TUNEL标记细胞,细胞核呈棕黄色~黄色(阴性细胞核蓝色),核固缩呈圆形或不规则形;高倍镜下可见染色质深染聚集成块或碎裂,核边聚等,符合凋亡细胞形态变化。此后各组TUNEL阳性细胞明显增多,其中Pilo组72 h达高峰; SE后6 h,TGF组大鼠海马CA1和CA3区TUNEL阳性细胞与Pilo组比较无统计学差异;SE后24 h、48 h、72 h,TGF组大鼠海马CA1和CA3区TUNEL阳性细胞均较Pilo组显著减少(P < 0.05);其中72 h最为明显(P < 0.01)。Pilo组和TGF组大鼠海马TUNEL阳性细胞数较正常对照组(Control)均有极显著性差异(P < 0.01)。(4)正常对照组大鼠海马未见Bcl-2阳性细胞或仅有微量的基础表达,主要为胞浆或核膜着色,呈棕黄色或棕褐色。Pilo组和TGF组大鼠海马均可见Bcl-2阳性细胞,主要分布在海马CA1和CA3区。SE后6 h各组大鼠海马Bcl-2阳性细胞有较明显的表达,此后各组Bcl-2阳性细胞逐渐增多;其中Pilo组48 h达高峰,SE后72 h较48 h下降; SE后6 h,TGF组大鼠海马CA1和CA3区Bcl-2阳性细胞与Pilo组比较无统计学差异;SE后24 h、48 h、72 h,TGF组大鼠海马CA1和CA3区Bcl-2阳性细胞均较Pilo组显著减少(P < 0.05);其中24 h最为明显(P < 0.01)。(P < 0.01)。Pilo组和TGF组大鼠海马Bcl-2阳性细胞数较正常对照组(Control)均有极显著性差异(P < 0.01)。(5)Caspase-3主要表达于细胞质或细胞核,呈棕黄色或棕褐色。正常对照组大鼠海马未见Caspase-3阳性细胞或仅有微量的基础表达; Pilo组和TGF组大鼠海马均可见Caspase-3阳性细胞,主要分布在海马CA1和CA3区。各组大鼠海马Caspase-3阳性细胞的动态变化及实验结果与TUNEL染色的观察结果相一致。(6)正常对照组大鼠海马未见Bax阳性细胞或仅有微量的基础表达,主要为胞浆或核膜着色,呈棕褐色。各组大鼠海马Bax阳性细胞的动态变化及实验结果与TUNEL染色的观察结果相一致。结论:经鼻(IN)给予TGFβ1可以显著抑制或减轻癫痫持续状态大鼠海马神经元的变性与凋亡,从而发挥神经保护作用。其潜在的神经保护机制可能涉及上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax和Caspase-3蛋白表达。鼻腔给药是一种全新的可以避开血脑屏障阻隔的无创中枢给药途径,有希望为治疗癫痫、阿尔茨海默病或其它中枢神经系统疾病提供有实用前景的一条新思路。

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中英文缩略词表 5-6中文摘要 6-9英文摘要 9-13实验第一阶段 13-30 引言 13-14 材料与方法 14-18 结果 18-24 讨论 24-29 结论 29-30实验第二阶段 30-39 引言 30 材料与方法 30-32 结果 32-37 讨论 37-39 结论 39参考文献 39-46个人简历 46-48致谢 48-49综述(一) 49-56 参考文献 53-56综述(二) 56-64 参考文献 62-64

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