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松江鲈（Trachidermus fasciatus）群体的形态学与遗传学差异及其MHC Ⅰ A基因的克隆与原核表达

作　者: 张文学
导　师: 祝茜
学　校: 山东大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 松江鲈 MHCIA 蛋白表达 形态差异 多态性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 35次
引　用: 1次
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内容摘要


松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)隶属于鱼由形目(Scorpaeniformes),社父鱼科(Cottidae),松江鲈属(Trachidermus),为小型、底层、肉食、降海溯河洄游性鱼类,国家二级保护动物。目前仅在东北的鸭绿江、山东的青龙河以及浙江的富春江发现尚有松江鲈群体的分布。由于缺乏具体的种群生态学调查记录,松江鲈的种群现状和生存潜力尚不清楚。此外,对于以前在中国分布广泛的松江鲈,其种群数量的锐减是否会导致各地方群体出现分化这一问题也有待探讨。鉴于主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC分析在种群和保护遗传学中的优越性,本研究以威海和东营群体共58条松江鲈为研究对象,分析了其MHC I a2的基因多态性,同时结合形态学分析方法,从宏观和微观上分析两个群体的差异。近年来,松江鲈的人工养殖技术逐步成熟,其养殖前景和经济价值巨大,而与其相应的鱼体免疫学研究还未见报道,MHC作为免疫系统中对蛋白抗原异物起反应的一类重要的免疫因子,广泛存在于脊椎动物体内。本研究利用RACE技术得到MHC I A基因全序列,并通过构建pET-30a表达载体,获得了MHC I A和IGC1 (Immunoglobulin-like Region)重组蛋白,为研究松江鲈MHC的免疫机制提供了理论基础。对松江鲈14个量度性状和11个比例性状进行独立样本T检验,结果显示松江鲈雌雄之间外部形态无显著差异,可将雌雄合为一组比较。以松江鲈2个群体共93尾松江鲈为研究对象,对11个比例性状分别采用主成分分析、聚类分析、判别分析、单因子方差分析,并计算差异系数(C.D)。结果显示：判别分析可以将两个群体很好地分离,判别正确率达到97.8%；单因子方差分析表明两个群体具有差异性状主要位于头部(6个存在差异的变量中3个位于头部),差异系数结果显示：仅有两个性状差异接近亚种水平,这说明两个群体有向亚种进化的趋势,但仍未达到亚种差异水平。因此,它们之间的差异仍然是属于不同地理群体的差异。对威海和东营群体共58条松江鲈提取基因组DNA,进行了300多个克隆的测序,共获得了17个等位基因。结果表明有两个个体出现了5个等位基因,提不MHC I a2至少存在3个基因座。对MHC I a2的序列进行分析,结果发现存在20个变异位点,氨基酸变异率为16.9%,显示了较为丰富的多样性。其中,肽结合区(Peptide Binding Region, PBR)氨基酸变异率达到50%(4/8)高于非PBR区域氨基酸变异率12.3%(7/57),中性选择检验结果显示,Tajima’s D值和Fs值均大于0,但P值均大于0.01,推测其可能发生了瓶颈效应或平衡选择。MEGA3.1计算威海群体和东营群体的核苷酸序列的平均遗传距离为0.027,威海群体和东营群体的氨基酸序列的平均遗传距离为0.047,分子变异分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)结果显示：遗传变异接近90%位于群体内,10%位于群体间,Fst和Φst值分别为0.11606和0.10521,P值均小于0.01。这说明威海和东营群体之间有中等程度的遗传分化。本实验所获得MHC I全长属于经典的MHC I即MHC I A, MHC I A由信号肽、胞外结构域(多肽结合区和免疫球蛋白样区)、跨膜区和胞质区组成。MHC IA基因的氨基酸序列分析表明,MHC I A存在与抗原多肽结合的8个关键性氨基酸YYRTKWYY位点,包括两个半胱氨酸之间的143位苏氨酸、146位赖氨酸、147位色氨酸和160位酪氨酸。也存在α2微球蛋白结合位点,即115位谷氨酰胺、119位天冬酰胺、120位甘氨酸和122位天冬酰胺。采用Gamle-Robson和Chou-Fasman法对MHC I A蛋白分子的二级结构进行预测,结果表明：MHCIA属于混合型蛋白,运用软件Swiss-model对松江鲈MHC I A蛋白分子的空间结构进行预测,得到的空间结构与鸡的相似。通过构建pET-30a表达载体,用浓度为0.5 mM的IPTG 37℃诱导4h获得了较高表达量的MHC I和IGC1蛋白。SDS-PAGE检测这两种蛋白均以包涵体形式存在于沉淀中,经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱纯化,得到较纯蛋白,为以后制备单克性抗体和MHC四聚体提供了材料。

全文目录


中文摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
缩略词  16-17
第一章 威海和东营地区松江鲈群体的形态学差异  17-31
  1.1 松江鲈研究综述  17-19
    1.1.1 松江鲈生物学特征及分布  17-18
    1.1.2 松江鲈研究历史及现状  18
    1.1.3 松江鲈种群鉴别背景  18-19
  1.2 材料和方法  19-22
    1.2.1 材料  19-20
    1.2.2 测量方法  20-21
    1.2.3 数据处理  21-22
  1.3 实验结果  22-28
    1.3.1 两性异形比较  22-23
    1.3.2 相关与回归分析  23-24
    1.3.3 主成分分析  24-25
    1.3.4 聚类分析  25-26
    1.3.5 判别分析  26
    1.3.6 单因子方差分析  26-27
    1.3.7 差异系数  27-28
  1.4 讨论  28-31
    1.4.1 关于两性异形  28
    1.4.2 关于两个群体形态差异  28-31
第二章 松江鲈群体的遗传多样性分析  31-57
  2.1 主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)综述  31-35
    2.1.1 MHC基因简介  31
    2.1.2 MHC基因的分类  31-32
    2.1.3 鱼类MHC基因的研究  32-33
    2.1.4 MHC基因的生物学特性  33-34
    2.1.5 MHC基因多态性与鱼类种群遗传学和保护遗传学研究  34-35
  2.2 材料  35-37
    2.2.1 主要仪器设备  35-36
    2.2.2 主要试剂及溶液配制  36-37
    2.2.3 培养基及试剂盒  37
    2.2.4 菌株与载体  37
  2.3 方法  37-43
    2.3.1 引物设计  37-38
    2.3.2 基因组DNA的提取与检测  38-40
    2.3.3 PCR扩增  40
    2.3.4 PCR产物纯化、克隆与测序  40-42
    2.3.5 数据分析  42
    2.3.6 等位基因命名  42-43
  2.4 实验结果  43-53
    2.4.1 基因组DNA的提取与检测  43
    2.4.2 PCR扩增结果及检测  43-44
    2.4.3 MHCⅠα2序列测定结果与分析  44-49
    2.4.4 威海群体和东营群体MHCⅠα2序列遗传分化  49-50
    2.4.5 分子进化检验  50-51
    2.4.6 MHCⅠα2的系统发育分析  51-53
  2.5 讨论  53-55
    2.5.1 松江鲈MHCⅠα2序列多态性分析  53-54
    2.5.2 MHCⅠα2分子进化分析  54-55
    2.5.3 威海与东营群体MHCⅠα2遗传差异分析  55
  2.6 小结  55-57
第三章 松江鲈MHCⅠA基因的克降与序列分析  57-67
  3.1 材料与方法  57-60
    3.1.1 材料  57
    3.1.2 菌株和载体  57
    3.1.3 试剂和仪器  57
    3.1.4 主要试剂配制  57-58
    3.1.5 实验方法  58-60
    3.1.6 序列分析、同源比较及进化树构建  60
  3.2 结果与分析  60-65
    3.2.1 测序结果及序列分析  60-62
    3.2.2 MHCⅠA基因的氨基酸序列分析  62-63
    3.2.3 MHCⅠA基因二级结构和空间预测  63-64
    3.2.4 同源比对与进化树构建  64-65
  3.3 讨论  65-67
    3.3.1 松江鲈MHCⅠA基因的序列特征分析  65-66
    3.3.2 松江鲈MHCⅠA基因的空间结构分析  66
    3.3.3 MHCⅠA同源比对与进化分析  66-67
第四章 松江鲈MHCⅠA基因的原核表达载体构建,蛋白表达与纯化  67-79
  4.1 材料与方法  67-75
    4.1.1 实验材料  67
    4.1.2 菌株与载体  67
    4.1.3 试剂和仪器  67
    4.1.4 主要试剂配制  67-69
    4.1.5 实验方法  69-75
  4.2 结果与分析  75-77
    4.2.1 原核表达载体的构建  75
    4.2.2 重组菌的表达  75-76
    4.2.3 表达蛋白的可溶性分析  76
    4.2.4 蛋白纯化  76-77
  4.3 讨论  77-79
    4.3.1 表达蛋白的可溶性  77-78
    4.3.2 SDS-PAGE检测IGC1重组蛋白分子量偏大原因分析  78
    4.3.3 小结  78-79
第五章 结论  79-81
参考文献  81-93
致谢  93-94
学位论文评阅及答辩情况表  94

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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