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抗真菌抗生素的分离纯化及生物活性的初步研究

作　者: 张龙
导　师: 刘党生；吴文芳；纪有海
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 放线菌 菌种筛选 发酵条件 菌种鉴定 硅胶柱色谱 ESI-MS HPLC
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


迄今为止,已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌,而放线菌主要存在于土壤中,并在土壤菌种中占有相当大的比例,本实验所用的菌株FL1是在中科院应用生态研究所微生物室对2000多株土壤放线菌进行初筛,在得到的15个对真菌具有拮抗作用的菌株中,进一步复筛而得到的。实验采用玉米小斑菌为指示菌,使用琼脂块发酵结合摇瓶液体发酵法,对发酵液进行抗菌活性考察,发现其对水稻恶苗菌,玉米丝黑穗菌,玉米大斑菌,番茄灰霉菌,黄瓜枯萎菌,烟草赤星菌,西瓜炭疽菌,茄子褐斑菌等真菌均具有较好的抑菌效果,属广谱抗生素。此外,在对发酵液做的浸种实验中,还发现其对玉米、小麦、黄瓜等作物的种子均具有较好的促生长作用。为了提高抗生素的产量,本实验对发酵培养基及发酵条件进行了优化,在不同条件下测定抗生素对鉴定菌的抑菌效果,初步确定发酵培养条件为:培养温度28℃,摇瓶装液量为70mL/250mL,发酵周期4天。采用经典鉴定方法和分子生物学分类方法对放线菌FL1进行了鉴定。结果表明,放线菌FL1属于链霉菌属,烬灰类群,通过在NCBI数据库中比对,与白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseus）的16S ribosomal DNA gene同源性最高,达100.0%,但其形态特征,生理生化特性与该菌属有一定差异,因此初步认定其为Streptomycesalbogriseus的一个变种。对放线菌FL1的发酵液进行初步分离提取,得到具有生物活性的发酵上清液提取物,并考察了其物理化学性质,在此基础上进行了稳定性实验及纸层析、薄层层析实验,为进一步的分离纯化提供了依据。纸层析试验结果初步显示该抗生素可能属于氨基糖苷类或多烯类,但该抗生素的理化性质与此二类抗生素的性质均存在一定的差异。对于抗生素的分离纯化主要应用硅胶柱分离,活性物质在流动相为甲醇:氯仿=1:5梯度下洗脱出来;全波长紫外扫描发现其最大吸收波长为277nm。HPLC的色谱条件为:检测波长277nm,流动相为乙腈:磷酸二氢钾（0.02mol/L）=40:60,流速1.5mL/min。在tR=12.723min时出峰,分离度高,峰形良好。经ESI-MS检测,其分子量为495。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-12
第1章 前言  12-21
  1.1 生物农药的应用现状及发展动态  12-14
    1.1.1 生物农药的定义  12-13
    1.1.2 生物农药相比化学农药的优势  13
    1.1.3 我国生物农药的应用现状与发展  13-14
  1.2 农用抗生素的研究进展  14-16
    1.2.1 国外农用抗生素的研究进展  15-16
    1.2.2 国内农用抗生素的研究进展  16
  1.3 农用抗生素的开发模式与分离、纯化技术  16-18
    1.3.1 农用抗生素的开发步骤  16-17
    1.3.2 农用抗生素的分离纯化  17-18
  1.4 农用抗生素的发展前景  18-19
  1.5 立题依据  19-21
第2章 材料和方法  21-30
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 菌种  21
    2.1.2 指示菌 玉米小斑菌  21
    2.1.3 培养基  21
    2.1.4 主要试剂  21-22
  2.2 实验仪器  22
  2.3 实验方法  22-30
    2.3.1 活性菌株的筛选  22-23
    2.3.2 浸种实验  23
    2.3.3 菌种鉴定  23-26
    2.3.4 发酵条件的优化  26
    2.3.5 活性菌株所产抗生素的初步研究  26-28
    2.3.6 抗生素的分离纯化  28-30
第3章 结果与分析  30-48
  3.1 活性菌株的筛选  30-34
    3.1.1 活性菌株的初筛  30
    3.1.2 实验菌株的确定  30-32
    3.1.3 菌株 FL_1的单孢子分离  32-33
    3.1.4 FL_1发酵液的促植物生长作用  33-34
  3.2 菌株 FL_1的鉴定  34-38
    3.2.1 放线菌 FL_1的形态  34
    3.2.2 生理生化测定结果  34-35
    3.2.3 16S rDNA的扩增及序列测定分析  35-38
  3.3 菌株 FL_1发酵条件的优化  38-40
    3.3.1 摇瓶装液量的考察  38
    3.3.2 发酵周期的考察  38-39
    3.3.3 培养基成份的优化考察  39-40
  3.4 菌株 FL_1所产抗生素的初步研究  40-48
    3.4.1 抗生素的热、酸、碱稳定性试验  40-41
    3.4.2 发酵液预处理  41
    3.4.3 捷克八溶剂纸层析实验结果  41-43
    3.4.4 溶媒萃取  43
    3.4.5 薄层层析实验  43-44
    3.4.6 硅胶柱色谱分离抗生素  44-45
    3.4.7 全波长紫外扫描结果  45-46
    3.4.8 用 HPLC对活性组分进行分析检测  46-47
    3.4.9 活性组分 ESI-MS测定结果  47-48
讨论  48-50
结论  50-52
参考文献  52-55
附录  55-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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