学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

南方根结线虫RNAi胚致死效应基因的筛选与功能鉴定

作　者: 董雯雯
导　师: 唐乐尘；谢丙炎
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 南方根结线虫 RNA干扰秀丽小杆线虫胚致死效应基因功能
分类号: S432.45
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 125次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

根结线虫是一种极难防治的世界性分布的土传病害,每年可给农业造成约1000亿美元的损失,己然成为制约我国蔬菜种植业可持续发展的问题之一。由于根结线虫体积小,不能人工培养,世代长等难于进行体外与宿主的相互作用方面的研究,进展一直很缓慢。1998年在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)上发现了RNAi沉默现象,并于同一年完成全基因组测序,人们对C.elegans的关注度越来越高。随着RNAi机制的明确和应用技术的逐渐成熟,大规模、高通量鉴定C.elegans全基因组的功能逐渐展开。若能利用C.elegans的信息资源为研究根结线虫服务,将大大推动相关技术的发展。本文利用生物信息学技术对根结线虫的ESTs库和C.elegans的全基因组蛋白库进行了比对,得到一批有用的数据,为大规模确定植物寄生线虫基因功能奠定了基础。主要研究结果如下:1.利用温室条件,改进高效培养和收集根结线虫J2幼虫的方法,为后续大规模使用线虫材料提供了保障。实验证明采用改进的贝尔曼漏斗法,把纱布换成60目筛网,在筛网上铺一层面巾纸,可以使线虫通过而把杂质隔离开,能够最大程度地减少线虫收集的损失。2.采用生物信息学分析鉴定物种基因功能的方法。本研究利用充分的网络数据资源和现代生物信息学技术,比对了根结线虫ESTs库2455条序列和C.elegans的基因组蛋白库23212条序列,得到444个同源性很高的序列。结合比较基因组学和功能基因组学分析两个物种基因信息,从而推测南方根结线虫(Meloidgyneincognita)的基因功能,相比经典遗传学,此法可大规模预测物种的基因功能。然后根据C.elegans RNAi效果挑选具有胚致死效应序列进行功能验证。所选基因要符合两个条件才能做交叉干扰:第一,该基因序列与模式线虫至少有连续的21-23 nt的精确匹配;第二,几百个碱基内该序列与模式线虫的基因同源性要高于60%。因此,我们选择了其中4个具有胚致死效应基因的片段进行交叉RNAi功能鉴定。3.应用并证实了物种间“交叉干扰RNAi”技术。我们通过构建载体,把4个M.incognita基因片段插入到表达dsRNA的载体LITMUS 28i中,通过IPTG诱导体内合成dsRNA,干扰C.elegans。RNAi基因沉默技术相比传统基因敲除技术,具有大规模、高效、快捷、省时省力、容易观察等优势,是传统方法不可比拟的。结果发现此4个基因在不同程度上对C.elegans的胚胎形成和阴门有一定影响。这表明,靶标基因在线虫胚胎发育阶段起重要作用。4.为了更明确此4个M.incognita基因片段的功能,本文采用1%的间苯二酚作为刺激物,体外转录合成dsRNA浸泡M.incognita J2幼虫。6h摇床悬浮浸泡后,可观察到处理线虫活性明显降低,再次证明沉默此4个基因片段对M.incognita具重要影响。由此证明本研究采用生物信息学技术分析基因功能的方法切实可行,为大规模鉴定物种全基因组功能提供了新的思路。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡,采用摇床培养悬浮线虫溶液,大大改善了这一状况。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
1 前言  11-21
  1.1 南方根结线虫及其危害  11-14
    1.1.1 分类地位  11
    1.1.2 形态特征  11-12
    1.1.3 起源与分布  12
    1.1.4 侵染循环  12-13
    1.1.5 寄主范围及为害症状  13
    1.1.6 防治  13-14
  1.2 线虫RNAi研究进展  14-20
    1.2.1 秀丽小杆线虫  14-15
    1.2.2 RNAi干扰  15-16
    1.2.3 RNAi作用机制  16-17
    1.2.4 秀丽小杆线虫RNAi研究进展  17-18
    1.2.5 根结线虫RNAi研究进展  18-19
    1.2.6 秀丽小杆线虫应用于根结线虫的研究  19-20
  1.3 本论文的研究内容及意义  20-21
2 南方根结线虫RNAi胚致死效应基因的筛选  21-25
  2.1 南方根结线虫的大量培养与收集纯化  21-22
    2.1.1 材料与方法  21-22
    2.1.2 结果与分析  22
  2.2 RNAi胚致死效应基因的筛选  22-23
    2.2.1 下载秀丽小杆线虫全基因组蛋白库  23
    2.2.2 搜集根结线虫ESTs库  23
    2.2.3 blastx比对  23
    2.2.4 结果与分析  23
  2.3 小结与讨论  23-25
3 RNAi胚致死效应基因的功能鉴定  25-51
  3.1 材料与方法  25-43
    3.1.1 供试材料  25
    3.1.2 主要试剂和酶类  25-26
    3.1.3 培养基  26
    3.1.4 常用试剂配制  26
    3.1.5 选定靶标基因片段  26-36
    3.1.6 总RNA提取  36
    3.1.7 cDNA的合成  36-37
    3.1.8 内参检测  37-38
    3.1.9 4个南方根结线虫基因部分片段的PCR扩增  38-39
    3.1.10 扩增片段的回收、克隆、测序  39-41
    3.1.11 载体构建  41-42
    3.1.12 HT115菌株电转化感受态的制备  42
    3.1.13 连接、转化和筛选  42
    3.1.14 秀丽小杆线虫培养及同步化  42
    3.1.15 RNAi表型观察  42-43
  3.2 结果与分析  43-50
    3.2.1 RNA的提取  43
    3.2.2 目的基因片段的克隆  43-45
    3.2.3 载体双酶切  45-47
    3.2.4 4个南方根结线虫基因RNAi表型鉴定  47-49
    3.2.5 RNAi表型统计  49-50
  3.3 小结与讨论  50-51
4 浸泡法验证胚致死效应基因功能  51-61
  4.1 材料与方法  51-55
    4.1.1 供试材料  51
    4.1.2 主要试剂和酶类  51
    4.1.3 4个南方根结线虫基因部分片段的PCR扩增  51-52
    4.1.4 载体构建  52-53
    4.1.5 质粒提取  53
    4.1.6 T7引物PCR扩增及产物纯化  53-54
    4.1.7 体外转录合成dsRNA  54-55
    4.1.8 FITC检测线虫的吞噬行为  55
    4.1.9 dsRNA处理线虫  55
  4.2 结果与分析  55-59
    4.2.1 4个南方根结线虫基因片段的PCR扩增  55
    4.2.2 合成dsRNA  55-57
    4.2.3 FITC检测线虫的吞噬行为  57
    4.2.4 dsRNA对南方根结线虫J2幼虫的影响  57-58
    4.2.5 浸泡RNAi表型统计  58-59
  4.3 小结与讨论  59-61
5 总结与讨论  61-62
参考文献  62-66
附录1 英文缩略表  66-67
致谢  67

南方根结线虫RNAi胚致死效应基因的筛选与功能鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文