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siRNA真核表达载体的构建及对MSTN基因表达抑制的研究

作　者: 马晓林
导　师: 刘明军；罗淑萍
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RNA干扰肌肉生长抑制素基因 C2C12细胞质粒DNA注射电击融合
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

肌生成抑制素基因(myostatin,MSTN)是肌肉生长的负调控因子,其变异或缺失会导致肌细胞增生与肌纤维肥大。RNA干扰(RNAi)是一种特异性降解靶基因mRNA序列的基因表达调节机制,具有高效、特异、快速等优点,已成为研究基因功能和表达调控的有效方法。目前通过合成siRNA来抑制MSTN基因表达或阻断与该基因功能相关的信号转导途径,已获得了双肌表现型的斑马鱼、大鼠及小鼠等,而利用该方法对绵羊MSTN基因的研究国内外还未见相关的报道。本实验目的在于筛选有效抑制绵羊myostatin基因的siRNA分子,以小鼠为模型研究siRNA对MSTN基因的抑制作用。通过设计8对针对绵羊MSTN mRNA序列siRNA单链引物,经过退火形成双链siRNA模板插入pSilencer(TM) 4.1-CMV neo载体,连接构建成Psi-mstn-siRNA载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time-PCR检测干扰效果,筛选有效的siRNA分子。结果表明所构建的8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。接着我们尝试着检验这两条siRNA分子在动物活体中的干扰作用。采用直接注射配合电击融合法将有活性的siRNA分子导入小鼠腓肠肌,两周后处死动物,采用realtime PCR及免疫组化法检测干扰分子对MSTN基因的抑制作用,利用组织切片、图像分析软件检测肌纤维面积的变化。结果表明注射psi-mstn-717和psi-mstn-986质粒的小鼠相对于注射对照质粒的小鼠,肌纤维面积分别增大33%和44%,各实验组小鼠MSTN mRNA及蛋白表达量没有呈现显著的变化。通过上述实验我们得出构建的两条siRNA重组质粒能有效的抑制MSTN mRNA的表达,并推测这两个分子在体内能够取得干扰MSTN表达的作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
文献综述  7-25
  第一章 MYOSTATIN基因的研究进展  7-16
    1 肌肉生长抑制素基因与双肌现象  7
    2 Myostatin 基因的结构性状  7-8
    3 Myostatin 的表达特异性  8-9
    4 Myostatin 的作用机制  9-13
    5 人为阻断Myostatin 活性的研究进展  13-14
    6 绵羊myostatin 研究进展  14-15
    7 应用前景  15-16
  第二章 RNA 干扰研究进展  16-25
    1 RNA 干扰简介  16
    2 RNA 沉默的发现与发展  16-17
    3 RNAi 的作用机制  17-18
    4 哺乳动物细胞中的RNAi  18-19
    5 siRNA 的制备  19-20
    6 siRNA 导入哺乳动物体内策略  20-21
    7 RNAi 的应用  21-22
    8 RNAi 在MSTN 基因功能研究中的应用  22-23
    9 问题与展望  23-24
    10 研究目的与意义  24-25
实验部分  25-54
  第三章 SIRNA 真核表达载体的构建和筛选  25-45
    1 试验材料及设备  26-29
    2 实验方法  29-38
    3 结果  38-43
    4 讨论  43-45
  第四章 SIRNA 分子对动物活体MSTN 的抑制效应  45-54
    1 试验材料及设备  46-47
    2 试验方法  47-50
    3 结果  50-52
    4 讨论  52-54
实验总结论  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
作者简介  60

siRNA真核表达载体的构建及对MSTN基因表达抑制的研究

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