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抗AMP单抗的制备及牛奶中AMP残留ELISA检测方法的建立

作　者: 黄丽
导　师: 刘成梅
学　校: 南昌大学
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: 氨苄青霉素 牛奶抗生素残留检测 单克隆抗体 酶联免疫吸附实验(ELISA)
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


氨苄青霉素（简称AMP）属于β-内酰胺类抗生素，是广谱半合成青霉素，抗菌谱比青霉素G广，对G+菌和G-菌均有较高的抗菌活性，是禽畜等农产品养殖中常用的抗生素类药物之一，在奶牛的饲养过程中青霉素药渣常被作为饲料添加剂和广泛应用于治疗奶牛的乳腺炎，尿道、生殖道、胃肠道呼吸系统等感染，从而造成牛奶中的残留，会给人们的健康和奶类发酵品的生产带来很大危害。因此，建立牛奶中氨苄青霉素残留快速检测方法具有重要的现实意义。本研究在制备AMP人工抗原的基础上，研制抗AMP单克隆抗体，建立AMP残留检测酶联免疫检测方法（ELISA）。主要实验结果如下：（1）采用戊二醛法和物理法将氨苄青霉素分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）两种载体蛋白偶联，制备免疫用和ELISA检测用抗原。以紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定偶联成功。应用L9（34）正交试验确定戊二醛法的最佳制备条件为：AMP与BSA的起始摩尔比40：1，25％戊二醛量10μl，反应时间4h；物理法的AMP与BSA最适起始摩尔比为20：1，反应时间3h。采用自行改良的BCA—紫外结合法测定最佳条件下制备的AMP人工抗原的偶联比，结果为戊二醛法制备的AMP人工抗原平均偶联比为10.23，物理法制备的AMP人工抗原平均偶联比为17.68。物理法制备的AMP人工抗原的偶联比要明显高于戊二醛法。（2）将两种方法制备的人工抗原各免疫3只小鼠，四次免疫之后通过间接ELISA法测定各小鼠的效价达到1～5×104，以100ng／mL的AMP标品进行间接竞争ELISA实验，测定各血清各小鼠均呈现不同程度的阻断抑制，其中②号小鼠对的抑制率达到93.4％，敏感性最高。采用物理法制备的AMP人工抗原免疫小鼠后的抗血清对AMP标品的抑制率高于戊二醛法。运用杂交瘤技术选用②号小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合，融合孔率为21％，阳性孔率为5.4％。应用有限稀释法进行亚克隆，筛选到3个稳定分泌抗氨苄青霉素单抗的克隆，依次是X.5.2，X.16.3.5和X.16.4.8。挑选阳性最高、敏感性也最好的X.16.3.5克隆注射到小鼠体内制备腹水。采用辛酸—饱和硫酸铵法纯化腹水，纯化后抗体蛋白浓度为5.85mg／ml。间接ELISA测定腹水效价为3.2×105，IC50值约为12.5ng／ml，与载体蛋白OVA、BSA无交叉反应，与抗生素类药物庆大霉素、四环素、卡拉霉素、链霉素无交叉反应。筛选出的单克隆敏感性和特异性较高。（3）对ELISA各个条件进行了选择和优化。以PH8.0的Tris—HCL缓冲液为基质，应用间接竞争ELISA方法建立了检测AMP的标准曲线，检测线性范围为：0.5～500 ng／ml，回归方程为Y=32.539X+13.651，相关系数R2=0.982，灵敏度和最低检测线分别为13.09 ng／ml和0.77 ng／ml，批内和批间的变异系数分别为4.45％和5.80％，重现性较好。以缓冲液溶解的5％的脱脂牛奶为基质，成功建立了牛奶中检测AMP残留的标准曲线，得到的回归方程为Y=30.427X+13.773，线性范围为0.5～500ng／ml，相关系数R2=0.9904，灵敏度和最低检测线分别为15.51 ng／ml和0.75ng／ml。建立该检测方法的精密度实验，批内变异系数为4.35％＜5％、批间变异系数5.70％＜10％，对牛奶的5个水平的加标实验的平均回收率为93.64％，该方法的最低检测限能达到欧盟标准，重现性和准确性均较好。制备的抗AMP单克隆抗体和建立的ELISA检测方法可用于牛奶中AMP残留检测。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
第1章 绪论  13-29
  1.1 概述  13-14
    1.1.1 青霉素类抗生素概述  13
    1.1.2 氨苄青霉素概述  13-14
  1.2 牛奶中青霉素类抗生素残留的现状及危害  14-17
    1.2.1 牛奶中青霉素类抗生素残留的渠道  14-15
    1.2.2 牛奶中青霉素类抗生素残留的现状  15-16
    1.2.3 牛奶中氨苄青霉素残留的影响及危害  16-17
  1.3 对抗生素残留的管理  17-18
  1.4 国内外检测抗生素残留方法研究的现状  18-21
    1.4.1 微生物受阻检测法  18-19
    1.4.2 理化检测法  19
    1.4.3 免疫分析法  19-20
    1.4.4 ELISA技术在食品安全检测领域的应用概况  20-21
  1.5 ELISA方法两种重要试剂概述  21-25
    1.5.1 人工抗原  21-23
    1.5.2 单克隆抗体  23-25
  1.6 本课题的意义、主要研究内容和创新点  25-29
    1.6.1 本课题的意义  25
    1.6.2 本课题的主要研究内容  25-28
    1.6.3 本课题的创新点  28-29
第2章 AMP人工抗原的合成与鉴定  29-48
  2.1 概述  29-30
  2.2 实验试剂与器材  30-31
    2.2.1 主要试剂  30
    2.2.2 主要仪器与材料  30-31
  2.3 实验方法  31-37
    2.3.1 AMP人工抗原的合成  31-32
    2.3.2 抗原浓度的测定  32
    2.3.3 氨苄青霉素人工抗原的鉴定  32-34
    2.3.4 改良的BCA-紫外结合法测定AMP人工抗原偶联比  34-36
    2.3.5 免疫抗原最佳偶联条件的选择  36-37
  2.4 结果与讨论  37-47
    2.4.1 氨苄青霉素人工抗原的鉴定  37-41
    2.4.2 改良BCA─紫外结合法测定AMP人工抗原偶联比  41-44
    2.4.3 免疫抗原最佳偶联条件的选择  44-47
  2.5 本章小结  47-48
    2.5.1 AMP人工抗原的制备  47
    2.5.2 改良BCA─紫外结合法测定AMP人工抗原的偶联比  47
    2.5.3 最佳偶联条件的选择  47-48
第3章 抗氨苄青霉素单克隆抗体的制备与鉴定  48-67
  3.1 概述  48
  3.2 试验试剂与器材  48-50
    3.2.1 试验试剂  48-49
    3.2.2 主要材料和仪器  49-50
  3.3 试验方法  50-57
    3.3.1 主要试剂的配制  50
    3.3.2 动物免疫  50-52
    3.3.3 细胞融合  52-54
    3.3.4 杂交瘤细胞的筛选与克隆化培养  54-55
    3.3.5 阳性单克隆杂交瘤细胞的扩增与冻存  55
    3.3.6 单克隆抗体的大量制备  55
    3.3.7 腹水的纯化  55-56
    3.3.8 抗AMP单克隆抗体的鉴定  56-57
  3.4 实验结果与讨论  57-65
    3.4.1 抗原包被最适浓度及血清效价的测定结果  57-58
    3.4.2 小鼠血清敏感性测定结果  58-59
    3.4.3 杂交瘤细胞融合实验结果  59-62
    3.4.4 细胞冻存与复苏  62-63
    3.4.5 腹水纯化及浓度测定结果  63
    3.4.6 单抗腹水最佳抗原浓度及效价的测定结果  63-64
    3.4.7 抗AMP单抗敏感性测定(IC_(50)值)结果  64
    3.4.8 抗氨苄青霉素单克隆抗体特异性的测定(交叉反应)结果  64-65
  3.5 小结  65-67
    3.5.1 动物免疫  65-66
    3.5.2 杂交瘤细胞筛选  66
    3.5.3 抗AMP单抗鉴定  66-67
第4章 牛奶中AMP残留ELISA检测方法的建立  67-88
  4.1 概述  67
  4.2 实验试剂与器材  67-68
    4.2.1 主要试剂  67-68
    4.2.2 主要仪器和材料  68
  4.3 实验方法  68-73
    4.3.1 主要试剂的配制  68-69
    4.3.2 间接ELISA方法实验条件的优化  69-71
    4.3.3 AMP残留ELISA检测方法的建立  71-72
    4.3.4 牛奶中AMP残留间接竞争ELISA检测方法的建立  72-73
  4.4 结果与讨论  73-86
    4.4.1 ELISA实验缓冲体系的选择  73-74
    4.4.2 抗原包被条件的确定  74-75
    4.4.3 封闭液的确定  75-76
    4.4.4 封闭时间的确定  76-77
    4.4.5 抗原抗体反应时间的确定  77
    4.4.6 酶标二抗反应时间的确定  77-78
    4.4.7 洗液中Tween-20浓度的确定  78-79
    4.4.8 显色终止时间的确定  79-80
    4.4.9 重新确定抗原抗体最佳反应浓度  80-81
    4.4.10 最佳抗原种类的确定  81
    4.4.11 AMP残留检测间接竞争ELISA竞争抑制标准曲线的建立  81-82
    4.4.12 灵敏度与最低检测线  82-83
    4.4.13 精确度  83-84
    4.4.14 牛奶中AMP残留检测ELISA竞争抑制标准曲线的建立  84-85
    4.4.15 灵敏度与最低检测线  85
    4.4.16 精确度  85-86
    4.4.17 加标回收实验  86
  4.5 本章小结  86-88
    4.5.1 对ELISA实验各条件的优化  86-87
    4.5.2 AMP残留检测间接竞争ELISA标准曲线的建立  87
    4.5.3 牛奶中AMP残留检测间接竞争ELISA标准曲线的建立  87-88
第五章 结论与展望  88-91
  5.1 结论  88-89
  5.2 展望  89-91
致谢  91-92
参考文献  92-97
攻读学位期间的研究成果  97

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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