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香蕉枯萎镰刀菌1、4号小种rDNA-ITS序列分析及4号小种遗传转化体系建立

作　者: 王文华
导　师: 曾会才
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 香蕉枯萎镰刀菌 rDNA-ITS序列分析 T-DNA插入突变体遗传转化
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 307次
引　用: 2次
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内容摘要

由香蕉枯萎镰刀菌1、4号小种（Fusarium oxysporum f.sp. cubense race1/race4, Focr1/Focr4）引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害,其中Focr4的危害性最大,能侵染几乎所有的香蕉品种,由于Focr4的传入,给我国的香蕉生产带来了严重威胁。目前国内外均尚无十分有效的化学防治方法,也未培育出高抗的品种,其原因是香蕉枯萎病是维管束侵染的系统性病害,一般化学药剂不能凑效,长期不清楚香蕉枯萎镰刀菌的致病机理造成抗病育种靶标不明确。本研究通过研究来自海南不同市县及广东的Focr1和Focr4菌株的rDNA-ITS序列差异,找出1号小种与4号小种的单核苷酸共性差异,为快速检测香蕉枯萎镰刀菌1、4号小种提供理论依据;并通过研究建立Focr4的根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化（Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation, ATMT）体系,构建Focr4的T-DNA插入突变体库,研究建立突变体致病力离体快速测定方法,筛选致病力丧失突变体,旨在为克隆Focr4的致病相关基因,为阐明其致病的分子机理奠定基础。取得的主要研究结果如下:1.通过接种巴西香蕉和粉蕉进行致病性测定以及通过特异引物PBL/PBR、PCL/PDR进行PCR扩增,明确鉴定出供试的香蕉分离菌株Foc37为Focr4,粉蕉分离菌株Foc2为Focr1。2.通过对所供试的3个Focr1和5个Focr4菌株进行rDNA-ITS测序分析,明确了香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种和1号小种在rDNA-ITS序列的367bp与386bp位点存在两处共性差异,即4号生理小种在367bp与386bp位点的碱基均为T,而1号生理小种的碱基均为C。3.通过对Focr4和Focr1进行离体接种巴西香蕉和粉蕉的致病性测定试验,建立了一套Foc小种致病性大规模快速测定方法。4.筛选出了潮霉素在PDA培养基平板上对Focr4生长的最佳抑制浓度为150μg/ml。5.对根癌农杆菌介导的T-DNA插入Focr4的遗传转化体系的影响因子进行了优化,明确了共培养前用IM液体培养基（150μmol/L AS）诱导的最佳时间为6小时及以农杆菌OD₆₀₀为0.15和Focr4孢子浓度为1×10⁶个/ml等体积混合共培养48小时为最佳条件。6.建立了Focr4的T-DNA插入遗传转化体系,并利用该体系对Focr4进行遗传转化操作和转化质量检验,结果表明:平均每1×10⁶个Focr4孢子可得到150～200个抗潮霉素的阳性克隆;从获得的突变菌株中随机抽样,以质粒pBHt2中潮霉素磷酸转移酶基因编码区设计了一对引物及Hf/Hr进行PCR检测,参试菌株均能扩增到819bp的片段,表明转化子的假阳性率低。在无潮霉素选择压力条件下连续转接培养6代后,转化子的抗潮霉素表型仍然保持稳定,表明获得的突变菌株的插入标记能稳定遗传。7.通过对获得的Focr4 T-DNA插入突变体进行致病性测定筛选,获得了1个致病性完全丧失的突变体Focr40321和2个致病力严重减弱的突变体Focr40088和Focr40003,以及14个菌落形态或颜色变异的突变体。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
前言  9-24
  1 香蕉枯萎病分布及危害性  9-11
  2 香蕉枯萎病的化学防治  11
  3 香蕉枯萎病的生物防治  11-12
  4 香蕉枯萎病的抗病育种  12-13
  5 香蕉枯萎病的综合防治方法  13
  6 香蕉枯萎镰刀菌的生物学研究  13-17
    6.1 香蕉枯萎镰刀菌的分类及形态特征  13-14
    6.2 香蕉枯萎镰刀菌的寄主范围  14
    6.3 香蕉枯萎镰刀菌的生理小种及营养亲和型概况  14-15
    6.4 香蕉镰刀菌枯萎病的发病规律  15-16
    6.5 香蕉枯萎镰刀菌的分子生物学研究  16-17
  7 根癌农杆菌介导真菌的转化  17-22
    7.1 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理  19
    7.2 影响根癌农杆菌遗传转化的因素  19-21
    7.3 T-DNA 在真菌中的存在方式  21-22
    7.4 根癌农杆菌介导转化的特点  22
  8 引言  22-24
第一部分 Focr1 和Focr4 的鉴定及其rDNA－ITS 序列的分析  24-39
  1 材料和方法  24-30
    1.1 材料  24-25
      1.1.1 植物材料  24
      1.1.2 菌种和质粒  24
      1.1.3 主要培养基的配制  24
      1.1.4 常用酶和生化试剂  24-25
    1.2 实验方法  25-30
      1.2.1 病原菌的分离和纯化  25
      1.2.2 病原菌致病性鉴定  25
      1.2.3 特异引物PCR 检测  25-27
      1.2.4 香蕉枯萎镰刀菌rDNA-ITS 区域序列扩增及分析  27-30
      1.2.5 病原菌离体叶片接种方法的探索  30
  2 结果与分析  30-37
    2.1 分离菌株的形态特征  30-31
    2.2 病原菌生理小种鉴定  31-33
    2.3 香蕉枯萎镰刀菌rDNA-ITS 区域序列扩增及分析  33-37
    2.4 病原菌离体叶片接种方法研究结果  37
  3 讨论  37-39
    3.1 关于香蕉枯萎镰刀菌生理小种的鉴定方法  37-38
    3.2 关于同源性分析在区分种内不同专化型及生理小种上的作用  38-39
第二部分 T-DNA 介导香蕉枯萎镰刀菌4 号生理小种遗传转化体系建立  39-55
  1 材料与方法  39-44
    1.1 材料  39-40
      1.1.1 供试菌株和转化质粒  39
      1.1.2 试剂  39-40
      1.1.3 培养基的配制  40
    1.2 方法  40-44
      1.2.1 Focr4 对潮霉素敏感实验  40
      1.2.2 农杆菌AGL-1 中质粒DNA 的小量制备  40-41
      1.2.3 共培养的方法  41-42
      1.2.4 共培养过程条件的优化  42-43
      1.2.5 转化子的PCR 检测  43
      1.2.6 转化子抗潮霉素稳定性测验  43-44
      1.2.7 转化子生长对比检测结果  44
      1.2.8 转化子的表型分析  44
      1.2.9 致病相关突变体的筛选  44
  2 结果与分析  44-53
    2.1 Focr4 菌株Foc37 对潮霉素敏感实验  44-45
    2.2 农杆菌AGL-1 中pBHt2 质粒的提取  45-46
    2.3 共培养条件的优化  46-49
    2.4 转化子的PCR 检测  49
    2.5 转化子抗潮霉素稳定性测验  49-50
    2.6 转化子生长对比检测结果  50
    2.7 转化子的形态学观察与分析  50-51
    2.8 致病相关突变体的筛选  51-53
  3 讨论  53-55
结论  55-56
参考文献  56-62
附录  62-64
致谢  64

香蕉枯萎镰刀菌1、4号小种rDNA-ITS序列分析及4号小种遗传转化体系建立

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