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转基因大豆及其制品检测技术的研究

作　者: 余春燕
导　师: 励建荣
学　校: 浙江工商大学
专　业: 食品科学
关键词: 转基因大豆豆制品外源基因检测定性PCR 巢式PCR 荧光定量PCR
分类号: TS214.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

转基因大豆及其制品日益增多，已经直接或间接地影响到人们的生活。也正因如此，转基因大豆及其制品对人体健康及生态环境的影响引起人们的广泛关注。为满足消费者选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测手段也越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。随着各国有关转基因标签法的建立和不断完善，对食品中的转基因成分含量的下限已有所规定，而且阈值越来越低。这就要求各国不仅能使定性检测技术日趋简捷和准确，更要求能探索出更加适合检测需要的定量手段。基于目前国际上对转基因食品还没有建立统一完善的定性和定量检测体系，为了探索建立转基因检测体系的策略，本研究以抗草甘膦转基因大豆及其加工产品为材料，试图建立经济灵敏、准确可靠的转基因大豆及其制品的内外源基因检测体系。本研究主要取得了以下结果：1、建立了以CTAB法为基础的转基因大豆及其粗加工和深加工产品抽提基因组DNA的技术。其结果显示：利用传统CTAB法对大豆种子抽提的基因组DNA基本完整，能完全满足PCR扩增要求；对粗加工产品（豆粕，豆奶粉）而言，延长CTAB法中抽提缓冲液的抽提时间为40～60min能得到基本完整的DNA；而对于深加工制品色拉油而言，在此基础上还需增加前处理阶段，即将样品适量溶解于TE缓冲液并充分混匀搅拌；此外对于酱油而言，抽提前用100mmoL/L的Tris-HCl洗2～3次可在DNA溶出前去掉水溶性和部分脂溶性色素以及部分多糖。2、设计合成检测转基因大豆内源基因Lectin、外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子及抗除草剂基因EPSPS基因的特异性引物。应用优化的常规PCR方法，对大豆及其加工产品豆粕、豆奶粉、酱油、色拉油等进行了检测。所有样品均检测到内标基因Lectin，其中在大豆和豆粕、豆奶粉中用此法可检测到外源基因CaMV35S、NOS和EPSPS基因片段。3、采用常规PCR技术在深加工产品色拉油、酱油样品中未检测出外源基因CaMV35S启动子和NOS终止子，故利用巢式PCR技术，设计两对引物，成功扩增出CaMV35S启动子的大小两段基因片段，分别为195bp和117bp。本研究建立的常规PCR方法检测的相对灵敏度可达到0.1％，完全满足国际检测的需求。4、利用TaqMan^?探针法荧光定量PCR技术对转基因大豆及豆粕进行荧光定量PCR检测技术的研究，从内源Lectin基因的扩增情况表明TaqMan^?探针法荧光定量PCR技术重现性和灵敏度良好。在此基础上本文对大豆和豆粕的CaMV35S启动子和EPSPS基因分别进行了定量检测。结果表明在对转基因大豆的检测中，由CaMV35S启动子和目的基因EPSPS标准曲线计算得出样品中转基因百分含量分别为3.02％和3.00％，两者相差0.02％；在转基因豆粕的检测中，由CaMV35S启动子和目的基因EPSPS标准曲线计算得出样品中转基因百分含量分别为3.48％和3.49％，两者相差0.01％；且R²值都达到了0.99以上，可作为大豆和豆粕中转基因成分定量检测的供选方法。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章引言  10-28
  第一节全球转基因作物发展概况  10-13
    一、国外转基因作物发展概况  10-11
    二、转基因大豆的发展概况  11-12
    三、转基因作物的主要种类  12
    四、中国转基因作物发展概况  12-13
  第二节转基因食品的安全性问题  13-15
    一、转基因 RR 大豆外源基因整合情况  14-15
    二、转基因大豆及其制品对人体的影响  15
  第三节实质等同性原则 (Substantial Equivalence)  15-17
  第四节我国对转基因大豆的态度  17-18
  第五节转基因标签制度  18-21
  第六节转基因作物的检测技术  21-26
    一、酶联免疫法 (ELISA) 检测技术  21-22
    二、传统定性 PCR 检测技术  22
    三、巢式 PCR 检测技术  22-23
    四、荧光定量 PCR 检测技术  23-26
  第七节本课题的目的与意义  26-28
第二章实验材料与方法  28-38
  第一节实验材料  28-30
    一、实验原料  28
    二、实验试剂  28-29
    三、实验仪器及耗材  29-30
    四、数据处理  30
  第二节实验方法  30-38
    一、基因组 DNA 的提取  30-32
    二、定性 PCR 检测体系的确立  32-35
    三、定量 PCR 检测体系的确立  35-38
第三章转基因大豆及制品的定性检测结果分析  38-49
  第一节样品基因组 DNA 分析  38-39
  第二节大豆及制品基因水平的检测  39-46
    一、内源参照基因 (Lectin) 的检测  39-40
    二、CaMV35S 启动子基因的检测  40-41
    三、NOS 终止子基因的检测  41-42
    四、目的基因 EPSPS 的检测  42-43
    五、巢式 PCR 对色拉油和酱油中外源基因 CaMV35S 的检测  43-45
    六、普通定性 PCR 相对检测底限  45-46
  第三节讨论  46-49
第四章转基因大豆及豆粕的定量检测结果分析  49-64
  第一节样品制备  49-50
  第二节 TaqMan~(?) 探针法检测的最低限度  50-52
    一、荧光 PCR 检测结果的重复性试验结果分析  50
    二、荧光 PCR 检测的最低限度(灵敏度)  50-52
  第三节 TaqMan~(?) 探针法定量检测大豆转基因成分结果  52-57
    一、Lectin 基因荧光定量 PCR 扩增  52-53
    二、CaMV35S 基因荧光定量 PCR 扩增  53-55
    三、EPSPS 基因荧光定量 PCR 扩增  55-57
  第四节 TaqMarn~(?) 探针法定量检测豆粕中转基因成分结果  57-61
    一、Lectin 基因荧光定量 PCR 扩增  57
    二、CaMV35S 基因荧光定量 PCR 扩增  57-59
    三、EPSPS 基因荧光定量 PCR 扩增  59-61
  第五节讨论  61-64
第五章结论  64-65
参考文献  65-70
附录缩略词表  70-71
致谢  71-72

转基因大豆及其制品检测技术的研究

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