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松材线虫的人工饲养和RNA干扰研究

作　者: 王守先
导　师: 孟智启
学　校: 浙江林学院
专　业: 森林保护学
关键词: 松材线虫 RNA干扰人工饲养 RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)
分类号: S763.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 332次
引　用: 1次
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内容摘要

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病是松树上的一种毁灭性病害,具有危害性大、传播速度快、防治难度大等特点,是世界性检疫对象。前人对松材线虫病的病源、致病机理以及防治技术进行了大量的研究。自发现松材线虫病起,国内外投入了大量的人力、物力和财力来防治该病,但该病到目前为止还没有得到有效控制,且仍有继续蔓延的趋势。本研究在前人研究的基础上就松材线虫简便有效人工饲养方法的建立和利用RNA干扰技术抑制松材线虫的繁殖进行了初步研究,结果表明:1.50条松材线虫在培养9天后就进入了大量繁殖的指数生长期,培养10天松材线虫的数量可扩大300倍,培养15天数量可扩大数千倍。2.在传统形态分类上,松材线虫和拟松材线虫主要依靠雌成虫的尾部特征来区分,幼虫则较难鉴定。本实验根据两者在ITS-1区的细小差别设计了引物,PCR反应后电泳,用SF+R引物能出现约340bp长度目的条带的就是松材线虫,而用NF+R引物有目的条带的为拟松材线虫,这样就可以准确地区分两个形态特征很相似的近缘种。3.松材线虫的单异活体培养不但操作简单,而且产量比较高。采用PDA平板培养灰葡萄孢,待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫,25℃恒温培养15天,然后漏斗收集是简便有效的松材线虫人工饲养方法。4.利用不同物种间关键基因的高度保守性,从秀丽隐杆线虫RNA聚合酶基因出发克隆了松材线虫RNA聚合酶基因片段,同时选用了带双启动子的载体LITUMS38i,成功构建了能表达双链目的片段的重组载体。5.松材线虫的RNA聚合酶基因片段双链RNA(dsRNA)通过对虫体浸泡可使双链RNA(dsRNA)干扰松材线虫的正常发育,从而有效地抑制松材线虫的繁殖。利用浸泡法进行松材线虫双链RNA(dsRNA)的干扰,在20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道的4℃浸泡的干扰效果。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
1 前言  10-30
  1.1 松材线虫的的研究现状  10-23
    1.1.1 松材线虫病的起源、传播方式、分布及其危害  10-13
    1.1.2 松材线虫病致病机理的研究进展  13-17
      1.1.2.1 松材线虫病病原的研究  13-15
      1.1.2.2 松材线虫病致病机理的研究  15-17
    1.1.3 松材线虫病的防治技术  17-23
      1.1.3.1 物理防治  18
      1.1.3.2 化学防治  18-19
      1.1.3.3 营林防治  19
      1.1.3.4 生物防治  19-23
  1.2 RNA 干扰技术及其在线虫研究中的应用概况  23-29
    1.2.1 RNAi 的发现与探索  23-24
    1.2.2 RNAi 的作用机理及特点  24-26
    1.2.3 RNAi 技术在线虫基因功能研究中的概况  26-29
      1.2.3.1 RNAi 技术研究线虫基因功能的试验方法  26-27
      1.2.3.2 RNAi 在寄生线虫基因功能研究中的应用  27-29
  1.3 立题依据及研究内容  29-30
    1.3.1 立题依据  29-30
    1.3.2 研究内容  30
2 松材线虫简便有效的人工饲养方法和分子鉴定  30-37
  2.1 材料与方法  31-33
    2.1.1 材料  31
    2.1.2 方法  31-33
      2.1.2.1 松材线虫的分离  31
      2.1.2.2 PDA-真菌的制备  31-32
      2.1.2.3 玉米粒-真菌的制备  32
      2.1.2.4 松材线虫的消毒  32
      2.1.2.5 松材线虫的数量统计  32
      2.1.2.6 不同种类的真菌及真菌培养基对松材线虫繁殖的影响  32
      2.1.2.7 不同接种量对线虫繁殖的影响  32
      2.1.2.8 不同培养温度对线虫繁殖的影响  32
      2.1.2.9 松材线虫生长情况的调查  32
      2.1.2.10 引物设计  32-33
      2.1.2.11 单条线虫DNA 的提取  33
      2.1.2.12 线虫分子鉴定  33
  2.2 结果与分析  33-36
    2.2.1 不同种类的真菌及真菌培养基对松材线虫繁殖倍数的影响  33
    2.2.2 不同接种量对松材线虫繁殖的影响  33-34
    2.2.3 不同培养温度对松材线虫繁殖的影响  34
    2.2.4 松材线虫生长情况的调查  34
    2.2.5 线虫分子鉴定  34-36
  2.3 结论与讨论  36-37
    2.3.1 松材线虫简便有效的人工饲养  36
    2.3.2 松材线虫的分子鉴定  36-37
3 松材线虫 RNA 聚合酶基因片段的克隆和 RNA 干扰载体的构建  37-40
  3.1 材料和方法  37-38
    3.1.1 材料  37
      3.1.1.1 松材线虫  37
      3.1.1.2 主要试剂与仪器  37
      3.1.1.3 菌株  37
    3.1.2 方法  37-38
      3.1.2.1 引物设计  37
      3.1.2.2 单条线虫 DNA 的提取  37
      3.1.2.3 松材线虫 RNA 聚合酶基因片段克隆  37-38
      3.1.2.4 松材线虫RNA 聚合酶基因片段dsRNA 表达载体的构建  38
  3.2 结果与分析  38
    3.2.1 松材线虫RNA 聚合酶基因片段克隆  38
    3.2.2 松材线虫RNA 聚合酶基因片段dsRNA 表达载体的构建  38
  3.3 结论与讨论  38-40
4 松材线虫RNA 聚合酶基因片段的RNA 干扰研究  40-45
  4.1 材料与方法  40-42
    4.1.1 材料  40
      4.1.1.1 松材线虫  40
      4.1.1.2 主要试剂与仪器  40
    4.1.2 方法  40-42
      4.1.2.1 松材线虫RNA 聚合酶基因片段双链RNA 的合成、纯化以及纯度分析  40-41
      4.1.2.2 松材线虫RNA 聚合酶基因片段的RNA 干扰  41-42
  4.2 结果与分析  42-44
    4.2.1 松材线虫RNA 聚合酶基因片段双链RNA 的合成、纯化以及纯度分析  42
    4.2.2 松材线虫RNA 聚合酶基因片段的RNA 干扰结果  42-44
  4.3 结论与讨论  44-45
5 全文总结  45-47
  5.1 松材线虫简便有效的人工饲养方法和分子鉴定  45
  5.2 松材线虫RNA 聚合酶基因片段的克隆和RNA 干扰载体的构建  45
  5.3 松材线虫RNA 聚合酶基因片段的RNA 干扰  45-46
  5.4 问题探讨和研究展望  46-47
参考文献  47-57
导师简介  57-58
个人简介  58-59
致谢  59-60
附录  60-64

松材线虫的人工饲养和RNA干扰研究

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