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抗肝癌中药成分的高通量筛选及LCID-1作用机理研究

作　者: 张礼平
导　师: 陈国平
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: 高通量筛选 肝癌细胞 LCID-1 细胞凋亡
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


利用MTT法对抑制人肝癌HepG2细胞增殖药物进行高通量筛选,从20000个组分的中药提取分离产物库找到3个IC50在10μg/mL左右的活性组分。将这3个活性组分来源的中药材各20千克进行提取后多次分离纯化,直至分成单体,再次对这些单体进行活性检测,得到一个有活性的单体LCID-1。通过研究其对人肝癌HepG2细胞活性的影响,得到实验结果如下:1.MTT法检测结果显示HepG2细胞在LCID-1浓度分别为0.01、0.1、1、10、100、1000μg/mL作用72h后,HepG2细胞株生长抑制率分别为6.15%、30.58%、52.72%、70.64%、96.26%、98.05%;而相同条件下,小白鼠原代肝细胞株生长抑制率分别为5.92%、23.29%、41.94%、58.71%、81.59%、95.20%。表明LCID-1对HepG2细胞有显著抑制作用,并与浓度正相关。且对正常细胞的毒性较对肝癌细胞要小。2.TUNEL检测显示,在浓度为1μg/mL的LCID-1作用前HepG2细胞株未见凋亡现象,作用后32.7﹪±4.8﹪的细胞核染成棕黄色,呈现凋亡征象。3.RT-PCR检测结果显示,人肝癌细胞株HepG2存在Bcl-2 mRNA及Ki-67 mRNA的转录,而不同浓度LCID-1作用后,其转录水平随其浓度增加而下调。4.免疫细胞化学染色显示,未经药物作用的细胞,其Bcl-2及Ki-67蛋白呈强阳性表达;在浓度为1μg/mL的LCID-1作用后,其表达水平显著下降。体外HepG2细胞活性实验表明,中药提取物LCID-1作为治疗肝癌的候选药物或先导化合物具有良好价值。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-11
1 绪论  11-25
  1.1 中药提取分离产物库  11-13
  1.2 中药化学成分提取分离方法与技术  13-16
    1.2.1 中药传统溶剂提取方法  14-15
    1.2.2 中药成分LCID-1 提取、分离、纯化及理化性质检测  15-16
  1.3 肝癌药物治疗及其新药筛选  16-18
  1.4 高通量药物筛选技术  18-23
    1.4.1 药物筛选模型  18-19
    1.4.2 肿瘤与细胞凋亡的关系  19-20
    1.4.3 中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究现状  20-22
    1.4.4 高通量药物筛选库  22-23
  1.5 课题的研究目的及意义  23-24
  1.6 课题研究的主要技术路线  24
  1.7 主要创新点  24-25
2 中药提取和分离  25-29
  2.1 实验材料  25
    2.1.1 主要仪器  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 中药材料  25
  2.2 实验方法  25-27
  2.3 实验结果与分析  27-29
3 抗肝癌中药成分的高通量筛选  29-42
  3.1 实验材料  30-31
    3.1.1 主要仪器  30
    3.1.2 细胞株  30
    3.1.3 实验药物及主要试剂配制  30-31
  3.2 实验方法  31-32
    3.2.1 人肝癌细胞株 HepG2 复苏  31
    3.2.2 人肝癌细胞株 HepG2 传代培养  31
    3.2.3 HepG2 细胞生长曲线测定(MTT 实验方法)  31-32
    3.2.4 细胞活性检测(MTT 实验方法){初筛}  32
  3.3 结果与分析  32-42
    3.3.1 HepG2 细胞生长曲线  32-33
    3.3.2 抑制HepG2 细胞增殖的药物高通量筛选  33-36
    3.3.3 MTT 法测定样品LCID-1 对HepG2 细胞活性的影响  36-40
    3.3.4 LCID-1 作用小白鼠原代肝细胞后细胞活力的检测  40-42
4 中药提取分离物LCID-1 作用HEPG2 后的形态学检测  42-47
  4.1 实验材料  42-43
    4.1.1 主要仪器  42
    4.1.2 主要试剂配制  42-43
  4.2 实验方法  43
    4.2.1 HepG2 细胞培养方法  43
    4.2.2 普通倒置相差显微镜观察细胞形态  43
    4.2.3 透射电镜观察细胞形态  43
  4.3 实验结果与分析  43-47
    4.3.1 普通倒置相差显微镜观察细胞形态  43-45
    4.3.2 透射电镜观察细胞形态  45-47
5 TUNEL 染色检测中药提取分离物LCID-1 作用HEPG 后的细胞凋亡  47-50
  5.1 实验材料  47
    5.1.1 实验试剂  47
    5.1.2 主要试剂配制  47
  5.2 实验方法  47-48
    5.2.1 HepG2 细胞培养  47
    5.2.2 TUNEL 染色检测中药提取分离物LCID-1作用 HepG2 后的细胞凋亡  47-48
  5.3 实验结果与分析  48-50
6 RT-PCR 检测LCID-1 作用HEPG2 细胞后MRNA 转录  50-54
  6.1 实验材料  50
    6.1.1 主要仪器  50
    6.1.2 主要试剂  50
  6.2 实验方法  50-52
    6.2.1 HepG2 细胞培养  50-51
    6.2.2 RT-PCR 检测LCID-1 作用HepG2 细胞后m RNA 转录  51-52
  6.3 实验结果与分析  52-54
7 细胞免疫化学染色检测BCL-2、KI-67 表达  54-58
  7.1 实验材料  54
    7.1.1 主要仪器  54
    7.1.2 主要试剂  54
  7.2 实验方法  54-55
    7.2.1 HepG2 细胞培养  54-55
    7.2.2 细胞免疫化学染色检测bcl-2、Ki-67 表达  55
  7.3 实验结果与分析  55-58
8 结论与展望  58-60
  8.1 总结  58
  8.2 展望  58-60
致谢  60-61
参考文献  61-63
附录  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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