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雌激素对H9c2细胞糖代谢关键酶活性的影响及其机制的初步研究

作　者: 张捷平
导　师: 宋惠萍
学　校: 中南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 雌激素磷酸果糖激酶糖原合酶异柠檬酸脱氢酶基因表达 H9c2细胞
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

胰岛素抵抗，是指外周组织及器官，主要是骨骼肌、脂肪组织及肝脏，对生理水平胰岛素的敏感性及反应性低于正常的效应。因而正常量的胰岛素产生低于正常的生理效应。在不同疾病状态下所产生的胰岛素抵抗，其机制不尽相同。绝经后妇女的雌激素水平明显下降。绝经后妇女的出现肥胖与胰岛素抵抗，并发展为2型糖尿病的机率明显增加，而糖尿病患者的心血管疾病的发病率明显增高，说明胰岛素抵抗与心血管疾病的发生有着密切联系。有研究表明，雌激素对治疗更年期妇女胰岛素抵抗综合症、预防心血管疾病起非常重要的作用。雌激素替代能在短期内降低绝经后妇女空腹血清葡萄糖水平、胰岛素水平，提高胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗综合症，并使绝经后妇女的心血管疾病发生率减少35-50％。2002年7月，美国国立卫生研究院妇女健康倡议（WHI）的一项临床试验结果表明，使用激素替代疗法的女性患中风和心脏病明显增加，并建议中止激素替代治疗。然而国内外许多专家仍支持激素替代疗法并认为：WHI的研究主要目的是研究激素替代疗法与心血管疾病和乳腺癌发病风险的关系，并没有全面总结激素替代疗法的益处。激素替代治疗的利与弊再次成为当前研究的一个热点。2005年，Michael E．等科学家在Science杂志上指出：为了合理客观评价雌激素对心血管系统的作用，需从细胞和分子水平研究揭示其作用机制，从而阐明其利与弊。本论文从细胞水平和分子水平深入探讨雌激素对心肌细胞H9c2糖代谢的影响及其机制，并为理解合理使用激素替代疗法提供有力的理论依据。方法：H9c2细胞用含10％去雌激素胎牛血清的DMEM培基（采用右旋糖苷T-70包裹的活性碳吸附法去除血清中的雌激素），在37℃，5％CO₂环境中培养。待细胞生长至60％汇合，用无血清DMEM培基洗涤，并在无血清DMEM培基中培养1小时，然后将细胞培养在含2％的去雌激素牛血清的DMEM培基中，并进行如下处理：（1）细胞分3组，在无雌激素培养24小时后，0，1 nM，100 nM的E2处理10分钟，0浓度E2组为对照组；（2）细胞分5组，分别用0，0.01 nM，1nM，100nM，1μM的E2处理24小时，0浓度E2组为对照组；（3）细胞分4组，分别用1 nM E2，0 E2，1 nM E2+10 nM ICI和1 nM E2+100 nM ICI处理24小时，1 nM E2组为对照组。每组5个样品。检测（1）测定葡萄糖代谢关键酶PFK、GS、ICDH活性；（2）半定量RT-PCR方法检测PFK-M、GS、ICDH-α在mRNA水平表达差异；（3）Western blotting检测PFK-M亚基、GS在蛋白质水平表达差异。结果：（1）经10分钟的雌激素作用后，1 nM E2和100 nM E2组中PFK活性与0浓度E2组的比较都无显著性差异（p＞0.05，p＞0.05）。1 nM和100 nM E2组中GS活性（总活性和活化活性）与0浓度E2组的比较都无显著性差异（p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05）。1 nM和100 nME2组中ICDH活性与对照组的比较都无显著性差异（p＞0.05，p＞0.05）。（2）经24小时雌激素作用后，0.01 nM、1 nM、100 nM及1μME2各组的PFK活性较0浓度E2组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。1 nM雌二醇组显著高于0.01 nM E2组（p＜0.05）、100nM E2组（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。同样的结果，见于GS的活性的变化。0.01 nM、1 nM、100 nM及1μM E2各组的GS活性（总活性和活化活性）较对照组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。1 nM E2组显著高于0.01 nM E2组（p＜0.05）、100 nM E2组（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。而0.01 nM、1 nM、100 nM及1μM E2各组中ICDH活性与对照组的比较都无显著性差异（p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05）。（3）雌激素受体抑制剂ICI 182，780（ICI）能降低1nM E2组的PFK活性与总GS的活性。其中1nM E2+10nM ICI组和1nM E2+100nM ICI组降低1nM E2所诱导增加的PFK活性约36％（p＜0.05）与70％（p＜0.05），1nM E2+10nM ICI组和1nM E2+100nM ICI组降低1nM E2所诱导的总GS活性38％（p＜0.05）与68％（p＜0.05）。（4） RT—PCR结果表明，0.01 nM、1 nM、100 nM和1μM E2各组的PFK-M其mRNA表达量较0浓度E2组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。其中1nM E2作用效果显著高于0.01 nME2组（p＜0.05），100 nM E2组（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。0.01 nM、1 nM、100 nM和1μM E2各组的GS mRNA表达量较0浓度E2组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。其中1nM E2作用效果显著高于0.01 nM E2组（p＜0.05），100 nM E2组（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。而0.01 nM，1 nM，100 nM和1μM E2各组ICDH-α亚基mRNA表达量与对照组没有显著性差异（p＞0.05，p＞0.05，p＞0.05和p＞0.05）。（5） Western blotting检测结果显示：0.01nM，1 nM 1 nM，100 nM及1μM E2刺激24小时以后，PFK-M的蛋白表达都较0浓度E2组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。1nM E2组PFK-M的蛋白表达显著高于0.01nM（p＜0.05），100 nM（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。同样，0.01nM，1 nM，100 nM及1μM E2组GS的蛋白表达都较0浓度E2组明显上升（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05和p＜0.05）。1nM E2组GS的蛋白表达量显著高于0.01nM（p＜0.05），100 nM（p＜0.05）和1μM E2组（p＜0.05）。（6）1nM E2+10nM ICI组能降低1nM E2所诱导增加的PFK-M的mRNA表达约35％（p＜0.05），1nM E2+100nM ICI组能降低1nME2所诱导增加的PFK-M mRNA表达约63％（p＜0.05）。相应组别中GS的mRNA表达量则降低约32％（p＜0.05）与60％（p＜0.05）。蛋白质水平上的改变与mRNA改变相一致。结论1．雌激素通过ER介导的方式，提高PFK与GS活性，促进PFK-M与GS在mRNA与蛋白质水平的表达，促进葡萄糖氧化利用，从而改善心肌糖代谢。2．雌激素通过基因表达而不是快速调节方式增加酶活性。3．E2不影响细胞ICDH的活性与ICDH-αmRNA表达。4．雌激素对酶活性的影响存在着剂量效应，其最适浓度是生理浓度（1 nM E2）。5．在绝经后妇女的激素替代治疗（HRT）中，选用适当的雌激素用量是关键。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-14
略语表  14-15
前言  15-17
技术路线  17-18
第一章材料与方法  18-25
  1.1 材料  18-19
  1.2 方法  19-25
    1.2.1 H9c2细胞培养  19
    1.2.2 葡萄糖代谢关键酶活性测定  19-21
    1.2.3 蛋白质含量的测定  21
    1.2.4 半定量RT-PCR检测PFK-M,GS,ICDH-α的mRNA水平表达  21-23
    1.2.5 Western blotting检测PFK-M,GS蛋白质的表达  23-25
第二章结果  25-35
  2.1 短期雌二醇刺激对H9c2细胞的PFK,GS,ICDH活性无影响  25-26
  2.2 雌二醇培养H9c2细胞24小时后,使其PFK和GS活性显著增加,但对ICDH的活性无影响  26-28
  2.3 ICI 182,780降低雌二醇诱导的H9c2细胞PFK和总GS活性的增加  28-30
  2.4 雌二醇对H9c2细胞PFK-M、GS和ICDH-α在mRNA水平表达的影响  30-31
  2.5 雌二醇对H9c2细胞PFK-M和GS在蛋白质水平表达的影响  31-32
  2.6 ICI182,780降低雌二醇所诱导的H9c2细胞PFK-M和GS在mRNA与蛋白质水平表达  32-35
第三章讨论  35-39
第四章结论  39-40
参考文献  40-46
综述  46-54
致谢  54-55
个人简历  55

雌激素对H9c2细胞糖代谢关键酶活性的影响及其机制的初步研究

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