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鸡白痢沙门氏菌抑制差减杂交文库的构建及ipaJ、mobA基因的克隆与表达

作　者: 李求春
导　师: 焦新安
学　校: 扬州大学
专　业: 遗传学
关键词: 鸡白痢沙门氏菌抑制差减杂交(SSH) ipaJ mobA 克隆表达
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 227次
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内容摘要

鸡白痢沙门氏菌多侵害20日龄以内幼雏,引起白色下痢,病死率极高,成年鸡则可带菌而无临床症状。该病既可垂直传播,又有严重的水平传播,所造成的危害和经济损失巨大。目前,在西方发达国家该病已经被消灭或基本消灭,然而在个别小的禽群中仍有发生,国内禽群鸡白痢的爆发仍较多。寻求鸡白痢沙门氏菌的致病基因对于了解其致病机理及有效地防治鸡白痢具有重要的意义。随着微生物基因组序列的大量测定,通过比较基因组差异分析致病微生物的分子致病机制已成为新近微生物基因组研究的一大热点。抑制性差减杂交方法(suppression subtractive hybridisation,SSH)的问世为微生物基因组学研究、致病基因和新基因的筛选提供了新技术。本研究利用SSH构建了鸡白痢沙门氏菌与肠炎沙门氏菌的差减文库,并对其中的部分序列进行了初步分析。1.鸡白痢沙门氏菌与肠炎沙门氏菌抑制差减杂交文库的构建应用抑制性差减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门氏菌533株与肠炎沙门氏菌50041株进行基因组片段的差异分析,构建了鸡白痢沙门氏菌的差减文库。经Dot-blot筛选,并对部分片段测序和同源性分析,结果表明这些序列主要分为4类:可移动遗传元件,III型分泌系统相关序列,质粒转移相关序列,未知功能序列。其中3个差减片段与编码福氏志贺菌侵入质粒抗原IpaJ蛋白基因的同源性达50%。本研究中构建的差减文库为研究鸡白痢沙门氏菌特异性致病基因和其致病机理提供了重要的材料。2.鸡白痢沙门氏菌ipaJ基因的克隆与表达鸡白痢沙门氏菌与肠炎沙门氏菌差减文库中的片段PEA2、PE31、PE44与猪霍乱沙门氏菌psfD10 ipaJ相应序列同源性分别达97%、99%和100%。将PEA2、PE31和PE44序列拼接后获得鸡白痢沙门氏菌完整的ipaJ序列,设计一对引物从鸡白痢沙门氏菌中克隆出ipaJ基因并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)上,诱导表达出37KDa的蛋白。Western-blot试验显示鸡白痢沙门氏菌阳性血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应。特异性实验表明ipaJ是鸡白痢沙门氏菌特有的基因。对97株不同来源的鸡白痢沙门氏菌分离株的PCR结果反映了ipaJ广泛存在于鸡白痢沙门氏菌中。本研究在国际上首次证实了ipaJ基因存在于鸡白痢沙门氏菌中,但对其功能的了解还有待于更深入的研究。3.鸡白痢沙门氏菌mobA基因的克隆与表达鸡白痢沙门氏菌与肠炎沙门氏菌抑制差减杂交文库中片段PE30与猪霍乱沙门氏菌psfD10 mobA基因序列同源性达99%。根据GenBank上发表的mobA基因序列,设计了一对引物从鸡白痢沙门氏菌标准株533中扩增出片段约为1.6kb的序列,将此序列构建到原核表达载体pET-30a(+)和pGEMX6p-1上,再将重组质粒分别转化入宿主菌BL21(DE3)和BL21中,在37℃,0.5mmol/L IPTG诱导下,分别表达出分子量约为64KDa和84KDa的蛋白质。将BL21(DE3)中的重组蛋白表达产物经His纯化柱回收后免疫小鼠,Western-blot试验显示免疫小鼠的血清与BL21中表达的MobA蛋白呈现特异性反应,这说明了体外表达的蛋白具有免疫原性。mobA基因的成功克隆与表达为进一步研究提供了条件。

全文目录

中文摘要  2-4
英文摘要  4-9
符号说明  9-10
第一章综述沙门氏菌毒力基因及其调控因子的研究概况  10-30
  一、SP11 编码的毒力基因  10-14
  二、SP12 编码的毒力基因  14-16
  三、位于其它毒力岛上的毒力基因  16-18
  四、调控因子  18-19
  五、总结  19-20
  参考文献  20-30
第二章鸡白痢沙门氏菌与肠炎沙门氏菌抑制差减杂交文库的构建  30-47
  1 材料与方法  30-38
  2 结果  38-43
  3 讨论  43-44
  参考文献  44-47
第三章鸡白痢沙门氏菌ipaJ 基因的克隆与表达  47-57
  1 材料与方法  47-52
  2 结果  52-54
  3 讨论  54-55
  参考文献  55-57
第四章鸡白痢沙门氏菌mobA 基因的克隆和表达  57-65
  1 材料与方法  57-59
  2 结果  59-62
  3 讨论  62-63
  参考文献  63-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表的学术论文  66

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