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KAI1基因转染人胰腺癌细胞的蛋白表达及增殖能力的研究

作　者: 任丽楠
导　师: 刘民培
学　校: 大连医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 肿瘤转移抑制基因 KAI1基因 肿瘤转移 胰腺肿瘤
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


目的 胰腺癌的突出特征是早期转移和手术切除率低，这些都严重威胁着人类的身体健康和生命。尽管放射治疗和包括健择在内的化学治疗已经应用于此癌，但这些作用仍不能有效的改善其生存率。因此不断探讨此癌治疗的新措施仍是胰腺癌研究中的重要内容之一。 KAI1基因是近年来新发现的一种与肿瘤转移抑制有关的基因，又称CD82分子。该基因定位于人类染色体11p11.2上，编码267个氨基酸的蛋白质，分子质量约29.61kD。根据其含4个跨膜结构域和一个细胞外亲水性结构域中有3个潜在糖基化位点等结构特点，其属TM4SF成员之一，并属细胞膜糖蛋白。目前的研究认为，KAI1基因的表达与多种肿瘤的转移呈负相关。KAI1蛋白作为TM4SF成员之一，虽然其抑制肿瘤转移的作用已在多种肿瘤中证实，但这种作用的机制至今尚不清楚。目前认为，这可能与其在细胞膜上的定位和广泛的糖基化，以及在细胞与细胞及细胞与细胞外基质的相互作用有关。该基因对肿瘤转移的这种抑制作用已引起广大学者的关注，因此探讨KAI1基因抑制胰腺癌转移的有关机制具有重要的实际意义。 方法 人胰腺癌细胞系MiaPacaⅡ为实验细胞，在含10％胎牛血清的DMEM完全培养液中，37℃和5％CO2条件下培养，约3天换液一次，并以0.25％的胰蛋白酶消化传代。采用脂质体介导法将含有目的基因的载体pCMV-KAI1导入上述细胞系中，同时以空载体pCMV-neo为阴性对照，并以G418 400μg／ml进行阳性筛选。用SP免疫细胞化学方法，以MiaPaca Ⅱ细胞为空白对照，pCMV-MiaPacaⅡ细胞作阴性对照，结肠癌组织作阳性对照来检测转染pCMV-KAI1、pCMV-neo及未转染MiaPacaⅡ细胞的CD82表达。在确定转染成功之后，用MTT（四唑蓝）法及集落形成实验检测该细胞系在转染前后其增殖能力的改变，以探讨KAI1基因对胰腺癌细胞增殖能力的影响。 结果①KAI1基因非转染的MiaPacaⅡ细胞经抗药基因neo的筛选，在G418为培养液的条件下，3天后开始出现细胞由原来的贴壁生长变为悬浮状态，且部分死亡，在14天内细胞全部死亡;而转染KAll基因及空载体的该种细胞在G418存在的条件下3天后同样出现细胞悬浮和部分的死亡，但在14天后依然有部分的细胞存活，在28天左右出现散在而小的细胞集落，35天后其集落细胞可行扩大培养，生长良好。转染KAll基因后的细胞形态似柳叶状，排列较转染前略为稀疏，细胞换液时间较转染前延长5一6天，大量扩增培养较困难。②在转染pcMVKAll的MiaPacall细胞中，其CD82在胞质中呈高表达，而未转染及转染空质粒的细胞呈低或无表达，故确认其目的基因KAll已成功转染至MiaPacan中。③MTT实验发现，转染pCMV一KAn基因细胞的增殉同转染前及转染空载体的同类细胞比较明显受抑（尸<0.05），而转染空载体与转染前的细胞相比无明显差异（P=0.731）。这些提示，转染KAll基因的胰腺癌细胞系MiaPacall的生长受到抑制，其恶性程度可能下降。④同等数量 （300个）的细胞分别在转染前后接种于培养皿中，两周后可见细胞集落形成，其中转染KAll基因的集落形成率为14.00%，转染空载体及转染前细胞的集落形成率分别为49.23%及49.56%。转染KAll基因与转染前及转染空载体之间的差异显著（尸<0.01），而转染空载体与未转染的细胞无显著性差别（拼O名6，P）0.05)。表明转染KAll基因的细胞其集落形成的能力受到明显抑制。 结论①重组KAll基因转染人胰腺癌高转移细胞系MiaPacan后，不仅可明显的抑制其生长，而且还可表达其翻译的KAll/C D82蛋白质。②通过MTT实验和集落形成实验说明KAll基因导入胰腺癌细胞系后，其增殖能力较转染前及转染空载体pCMV一neo者下降，这也可能使该细胞系的侵袭转移能力降低，进而使其恶性程度下降。③这些实验将为今后利用KAll基因在胰腺癌基因治疗等方法提供理论基础和实验依据。④脂质体介导的KAll基因转染人胰腺癌细胞系，是一种安全可靠的基因转移方法。

全文目录


一、 论文  4-27
  (一) 中文摘要  4-6
  (二) 英文摘要  6-9
  (三) 前言  9-10
  (四) 材料与方法  10-14
  (五) 结果  14-18
  (六) 讨论  18-23
  (七) 结论  23-24
  (八) 致谢  24-25
  (九) 参考文献  25-27
二、 文献综述  27-37
  (一) 综述  27-32
  (二) 参考文献  32-37

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胰腺肿瘤
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