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人类DNA损伤修复基因hR24L的克隆和功能研究

作　者: 李平法
导　师: 陈向伟；王辉
学　校: 山西医科大学
专　业: 免疫学
关键词: DNA损伤修复基因 hR24L基因基因克隆 MCF7细胞细胞转染细胞凋亡周期阻滞电离辐射
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

目的：克隆人类DNA损伤修复基因hR24L，构建其正义和反义表达载体重组体，为该基因的结构和功能研究奠定实验基础；用外源性hR24L基因转染哺乳动物细胞，得到稳定遗传的细胞系。观察转染细胞增殖速度的变化，检测细胞周期，了解外源性hR24L基因转染对哺乳动物细胞周期的影响，研究其作用机制；观察正义和反义hR24L基因转染对细胞凋亡的影响，了解修复基因与细胞凋亡的关系，为肿瘤的基因诊断和基因治疗(特别是反义核酸)的研究积累资料；研究电离辐射对哺乳动物细胞内源性hR24L表达的影响，了解其作用特点。方法：首先用PCR方法扩增hR24L的开放阅读框(ORF)，克隆入pGEM-T载体，经酶切鉴定和测序无突变后，重组到逆转录病毒表达载体(pDor-neo)中，得到正义和反义重组体(pDor-hR24Ls和pDor-hR24La)。然后用重组质粒和空载体分别转染MCF7细胞，筛选出阳性克隆，得到稳定遗传的细胞系，并用Southern印迹杂交证实外源性hR24L已成功整合到细胞基一2-因组中。观察细胞生长速度，与空载体转染细胞相比较。用Northern印迹杂交检测靶细胞hR24LmRNA的表达情况，用流式细胞仪检测细胞周期变化情况。接着用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿等方法分别诱导不同质粒转染的MCF7细胞发生凋亡，用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡情况。同时用Rl’- PCR方法从人乳腺癌MCF7细胞总RNA中扩增hR24L的ORF，经测序无突变后用Y射线照射细胞，用Northem印迹杂交分析hR24L表达变化。结果:正义hR24L转染细胞生长较慢，而反义hR24L转染细胞生长较快。进一步Northern印迹杂交发现，转入正义hR24L增加了靶细胞hR24LmRNA的表达，而转入反义hR24L则降低其表达，说明hR24L基因的表达抑制了细胞生长。流式细胞仪检测细胞周期表明，转染后6小时正义转染细胞G2+M期的比例(18%)明显高于其它三种细胞(6%)，说明hR24L蛋白升高时可以使细胞周期阻滞在GZ/M期，hR24L蛋白参与了细胞周期调控。诱导凋亡后发现，正义转染细胞的hR24LmRNA表达升高，其凋亡峰面积(21.21土2.42)t匕对照细胞(46.16士4.38)明显降低;反义转染细胞的hR24LmRNA表达则下降，但其凋亡峰面积(31.05士3.02)比对照细胞(46.16士4.38)也明显降低，表明正义和反义hR24L均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡，但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用。通过MCF7细胞内源性hR24LmRNA分析发现，经电离辐射后，hR24L基因的转录在lh后开始上升，Zh后达高峰，3h后恢复正常。结论:hR24L基因的表达可以抑制细胞增殖，其机制是引起细胞周期阻滞，参与细胞周期调控;正、反义hR24L基因都能抑制细胞凋亡，其作用机制可能通过影响复杂的信号传递途径;hR24L基因的表达具有损伤诱导性，其表达产物对Y射线诱导的损伤有修复作用。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
正文  10-36
小结  36-44
综述  44-62
参考文献  62-69
致谢  69

人类DNA损伤修复基因hR24L的克隆和功能研究

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