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家蚕AFLP图谱的构建和天蚕卵黄原蛋白基因的克隆

作　者: 赵爱春
导　师: 鲁成；梶浦善太
学　校: 西南农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: AFLP图谱全基因序列卵黄原蛋白家蚕天蚕
分类号: S881.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

家蚕是遗传学上具有重要地位的模式生物，是生物工程研究的理想材料，也是一种重要的经济昆虫，在我国的国民经济中占有极为重要的地位。家蚕分子连锁图谱的构建对促进家蚕分子生物学的研究和分子辅助育种具有重要的意义。利用分子标记技术寻找绿茧基因紧密连锁的分子标记，对绿茧基因进行定位，加速优质绿茧蚕品种的育成是十分迫切而必要的。天蚕蛾科的昆虫是目前所记载的鳞翅目昆虫中产卵最大的种类，这些昆虫卵的形成中，卵黄的形成和卵巢的发育相当活跃，其卵巢是生理学、生物化学及分子生物学上研究发育过程所期望的模式系统，对其卵的形成的研究具有重要意义。本实验利用天蚕基因组文库等，克隆了卵黄蛋白主要组分的卵黄原蛋白的全基因。主要结果如下： 1 家蚕AFLP图谱的构建扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，简称AFLP)技术是一种具有稳定性好和多态率高的优点的DNA指纹分析技术。目前已广泛应用于多种生物的连锁图图谱的构建、基因和QTL定位等，具有广泛的应用前景，近几年开始用于蚕。本研究中通过AFLP技术构建了一张家蚕的分子连锁图谱并定位独立绿茧基因在该连锁图谱上。具体结果如下： ’①使用了28对AFLP引物在家蚕品系C。和大造的回交子代中共扩增出3956个位点，其中 1018个为多态性位点，每组引物扩增出36．4个多态位点，693个位点符合盂德尔1：1分离；虐（9个位点（包括693个AFLP标记和CC形态标记）中的402个构成了33个连锁群，占总构图位点数的y，占总多态性的39．5％，占呈1：互分离标记的68．l％；另外还有122个标记不连锁，28个标记构成8个伪连锁群，伪连锁群是几个间距为OCM的不同的标记构成的连锁群；94个标记构成了47个二联体，48个标记构成11个类似二联体的连锁群即几个间距为0。回的不同的标记和另一个标记构成的连锁群：③33个连锁群中，包括25个主连锁群和8个次连锁群，主连锁群包含7～32个标记，次连锁群包含3～6个标记。标记间距离为0．0～！19．ga，平均间距为9．豆C回；标记数最多的为第14连锁群，含有32个标记，最少的为3个标记；最长的连锁群0。U昨的跨距为 496．二训最短的p。u昨9为粤．7。饲：④构成33个AFLP分子标记连锁群的标记数33个连锁群的总图距为3676 7CM，每条连锁群的平均图距为111．4CM，家蚕有28个经典的连锁群，而本实验所构建的连锁群数大于28，说明本实验中构建的连锁群有些应是相互连锁的，只是本实验数据中缺乏特定的标记将其整合在一起；⑤位于家蚕经典的第15号连锁群的形态标记阶被定位在该图谱中的第22连锁群的 L－P4T6－107与L－P6T4－84之间，这表明该分子连锁群可能与传统的家蚕形态标记图谱中的第15号连锁群对应。⑤本研究所构建的分子连锁图谱中的标记有较高的成族的现象，这可能是由于两个方面造成的，一方面是这些位点之间本身较为紧密连锁：另一方面是本研究中作图群体个体数的限制，不能有效分辨图距较小的两个标记。本研究中构建的家蚕图谱和绿茧基因的定位为进一步克隆家蚕绿茧基因和育成优质家蚕绿茧品种奠定了一定的基础。在育种中，借助与QTL和绿茧基因紧密连锁的分子标记并结合 7 V它们控制的数量和形态性状进行有目的的选择，加速优质绿茧品种育成的进程。2天蚕卵黄原蛋白的克隆天蚕卵黄原蛋白（Vg）是卵黄蛋白主要前体，幼虫·蛹蜕皮（变态蜕皮）到蛹早期阶段时在雌的脂肪体中合成。天蚕天然的卵黄原蛋白和卵黄磷蛋白（Vt）有若干不同种类的分子量，主要是由两个分子量分别为185kDa和44kDa的大小亚单位形成的四体蛋白构成。本实验中首先利用入 DASH 11／fbmHI载体构建了一个天蚕基因组 wA文库，然后根据天蚕的卵黄原蛋白的。wA序列设计不同的引物，筛选能在天蚕基因组DNA中特异扩增出适合大小的DNA片段的引物组合，并利用此引物组合成探针对构建的天蚕基因组文库进行筛选，最后对阳性克隆测序获得Vg基因核酸序列。具体结果如下：①利用 A DASHD／Bhmrrl载体构建了一个天蚕基因组 IhA文库。文库扩增共用了总扩增量为能产生 10e个噬菌斑的包装终产物。获得的扩增文库的滴度为 1．ZXI吓fU／．1；故本实验获得的扩增文库己经达到了筛选基因组中任一基因的统计要求的规模，滴度也适合长期稳定保存和利用；②本实验根据天蚕卵黄原蛋白基因CDNA序列设计了ZI个前弓！物和18个反向引物。筛选获得一对能在天蚕基因组DNA中特异扩增产生大?

全文目录

中文摘要  7-11
英文摘要  11-15
第一部分家蚕AFLP图谱的构建  15-46
  一文献综述  15-24
    1 分子连锁图谱的特点和应用  15-18
      1．1 分子连锁图谱的特点  15-16
      1．2 分子连锁图谱的应用  16-18
        1．2．1 连锁图在比较基因组作图中的应用  16
        1．2．2 利用分子连锁图进行数量性状基因定位  16-17
        1．2．3 连锁图谱在分子标记辅助育种中的应用  17-18
    2 家蚕分子连锁图谱的构建及其研究进展  18-20
      2．1 家蚕分子连锁图的构建  18-19
      2．2 连锁图谱在家蚕上的应用  19-20
    3 AFLP技术在遗传图谱构建中的应用  20-22
      3．1 AFLP技术  20-22
        3．1．1 AFLP的基本原理  21
        3．1．2 AFLP分析的一般过程  21-22
    4 自然有色织物利用的现状及前景  22-23
    5 绿茧基因及定位研究概况  23-24
  二序言  24-26
    1 研究背景及意义  24-25
    2 实验基本路线  25-26
  三家蚕的AFLP分析  26-40
    1 材料与方法  26-32
      1．1 作图材料  26
      1．2 主要仪器设备  26
      1．3 主要生化试剂及溶液的配制  26-27
      1．4 数据统计分析软件  27
      1．5 基因组DNA的制备  27
      1．6 模板DNA的制备  27-28
        1．6．1 基因组DNA的酶切  27
        1．6．2 接头的准备  27-28
        1．6．3 连接  28
      1．7 模板DNA的扩增  28-29
        1．7．1 预扩增  28
        1．7．2 选择性扩增  28-29
      1．8 扩增产物的凝胶电泳检测  29-30
        1．8．1 琼脂糖凝胶电泳检测  29
        1．8．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  29-30
      1．9 数据统计与分析  30-32
        1．9．1 AFLP标记的统计与分析  30-31
        1．9．2 连锁分析与作图  31-32
    2 结果与分析  32-40
      2．1 基因组DNA的制备  32-33
      2．2 扩增产物的凝胶电泳检测  33-34
        2．2．1 琼脂糖凝胶电泳检测  33
        2．2．2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  33-34
      2．3 数据统计与分析  34-40
        2．3．1 AFLP标记的统计与分析  34
        2．3．2 连锁分析与作图  34-40
  四讨论  40-46
    1 作图群体的大小  40-41
    2 作图材料的选择  41
    3 家蚕的雌不发生交换对F2作图群体的影响  41-44
    4 限制性内切酶的选择  44
    5 家蚕AFLP分子标记的分离模式  44-45
    6 目前的问题及解决的方法  45-46
第二部分天蚕卵黄原蛋白基因的克隆  46-89
  一文献综述  46-57
    1 蚕功能基因克隆研究  46
    2 鳞翅目昆虫有关卵形成的蛋白的研究  46-49
    3 卵黄原蛋白（Vgs）  49-56
      3．1 结构特性  50-51
      3．2 测序分析和比较  51-56
        3．2．1 聚丝氨酸区域  52-53
        3．2．2 Vg前体的剪切位点  53-55
        3．2．3 进化关系  55-56
    3．3 激素对卵黄原蛋白表达的影响  56-57
  二序言  57-60
    1 研究背景  57-58
    2 目的和意义  58-59
    3 研究基本路线  59-60
  三天蚕基因组DNA的抽提和文库的构建  60-67
    1 材料与方法  60-65
      1．1 天蚕材料  60
      1．2 主要仪器设备  60
      1．3 主要生化试剂及常用溶液的配制  60
      1．4 基因组DNA的制备  60-61
      1．5 基因组文库的构建  61-65
        1．5．1 基因组DNA的限制性内切酶的消化  61-62
        1．5．2 插入DNA片段和λDASHⅡ载体的连接  62-63
        1．5．3 重组载体的包装  63
        1．5．4 包装产物的滴度检测  63-64
        1．5．5 构建文库的扩增  64-65
    2 结果与分析  65-67
      2．1 基因组DNA的抽提  65
      2．2 文库的构建  65-67
        2．2．1 消化基因组DNA的限制性内切酶的选择  65
        2．2．2 载体的选择  65-66
        2．2．3 连接  66
        2．2．4 包装产物的滴定度  66
        2．2．5 构建的扩增文库  66-67
  四探针的制备和文库的筛选  67-75
    1 材料与方法  67-72
      1．1 天蚕基因组DNA和基因组文库材料  67
      1．2 主要仪器设备  67
      1．3 主要生化试剂及常用溶液的配制  67-68
      1．4 探针的制备  68-69
        1．4．1 合成探针引物的筛选  68
        1．4．2 探针的合成  68-69
      1．5 文库的筛选  69-72
        1．5．1 第一次筛选  69-71
        1．5．2 第二次筛选  71-72
        1．5．3 阳性噬菌斑的获得  72
    2 结果与分析  72-75
      2．1 探针的制备  72-73
      2．2 文库的筛选  73-75
  五阳性λ噬菌体的分析与测序  75-84
    1 材料与方法  75-77
      1．1 噬菌体菌株和天蚕基因组DNA  75
      1．2 主要仪器设备  75
      1．3 主要生化试剂及常用溶液  75
      1．4 λ噬菌体DNA的快速抽提  75-76
      1．5 阳性λ噬菌体DNA分析和测序  76-77
      1．6 天蚕基因组中内含子的扩增和测序  77
    2 结果与分析  77-84
      2．1 λ噬菌体DNA的快速抽提  77-78
      2．2 Vg基因的测序和分析  78-84
  六讨论  84-89
    1 昆虫卵黄原蛋白一级结构比较  84-86
    2 昆虫卵黄原蛋白最初转录模板的比较  86-87
    3 卵黄原蛋白表达的特点  87
    4 卵黄原蛋白被吸收的特点及应用  87-88
    5 目前存在的问题及展望  88-89
参考文献  89-100
发表论文及参加的研究课题  100-101
附录Ⅰ 缩写字符中、英文对照表  101-102
附录Ⅱ 构图位点的卡方检测值表  102-110
附表Ⅲ 实验中的引物名称及序列  110-112
致谢  112

家蚕AFLP图谱的构建和天蚕卵黄原蛋白基因的克隆

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