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家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子的鉴定及部分成员的克隆与功能分析

作　者: 栗凤鹏
导　师: 吴金美
学　校: 江苏科技大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子 B亚族基因组织表达 Bmwh2 siRNA 色素
分类号: S881
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette, ABC)广泛分布于从细菌到人类等各种生物体中,是最大的膜蛋白家族之一,它主要利用ATP水解释放能量实现多种底物的跨膜转运。ABC转运子在生物体内以全分子或半分子转运子的形式存在,全分子转运子由2个核苷酸结合域(nucleotide binding domain,NBD)和2个跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)构成,每个半分子转运子包括1个NBD和1个TMD,每个TMD一般由6个α螺旋构成,半分子转运子依赖形成同源或异源二聚体发挥作用,它们通过形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输。利用生物信息学知识,本文初步鉴别了家蚕基因组数据库中潜在的47个ABC转运蛋白,这些蛋白成员涵盖了ABC转运蛋白的8个亚族(ABCA-ABCH)。家蚕ABCC亚族是含有成员最多的亚族,有15个成员,其中有5个同源于果蝇的的多药耐药糖蛋白(multidrug resistance,MDR); ABCB亚族有9个成员,有4个与果蝇的多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)同源。目前,家蚕ABC转运蛋白研究相对较少,通过对家蚕ABC转运蛋白的初步鉴定,为进一步研究家蚕ABC转运蛋白的功能提供了条件。三磷酸腺苷结合盒转运子B亚族成员ABCB6 (ATP-binding cassette transporter isoform B6, ABCB6)是一个非常重要的半分子转运子,在哺乳动物中主要参与细胞内卟啉类化合物的转运和铁离子平衡的调节。利用人的ABCB6基因编码氨基酸序列在家蚕EST数据库中进行tblastn检索,把检索到的EST序列进行电子拼接,根据拼接结果设计引物进行RT-PCR扩增、克隆测序验证。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)成功克隆了家蚕Abcb亚族基因第1个成员BmAbcb6的完整开放阅读框。生物信息学方法分析发现,BmAbcb6有16个外显子和15个内含子,编码850个氨基酸残基,分子质量为96.35 kD,等电点8.23;BmAbcb6含有1个NBD和有10个α螺旋构成的TMD,是家蚕Abcb亚族成员。半定量RT-PCR方法分析BmAbcb6在家蚕5龄第3天幼虫不同组织中均有表达,其中以精巢中的表达量相对最高。研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增、克隆测序了家蚕ABC转运子Bmwh2完整的开放阅读框。生物信息学方法分析发现,Bmwh2有14个外显子和13个内含子,编码689个氨基酸残基,分子质量为77.38 kD,等电点8.42。Bmwh2含有1个NBD和6个α螺旋构成的TMD,为半转运子,属于家蚕ABC转运子超家族G亚族成员。半定量RT-PCR方法分析Bmwh2在家蚕5龄第3天幼虫不同组织的表达水平,以精巢中的表达量相对最高。通过显微注射仪,用合成的siRNA注射胚胎发育时期的蚕卵,对Bmwh2进行干涉研究,获得了白卵和嵌合体的干涉表型。根据实验结果,推测Bmwh2参与家蚕浆液膜色素前体的转运。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第1章绪论  14-21
  1.1 研究背景  14-20
    1.1.1 三磷酸腺苷结合盒转运子简介  14
    1.1.2 ABCG 亚族成员的研究进展  14-19
    1.1.3 家蚕ABC 转运子的研究进展  19-20
  1.2 研究的内容和意义  20-21
第2章家蚕ABC 转运子的鉴定  21-31
  2.1 引言  21
  2.2 材料和方法  21-22
    2.2.1 生物信息软件和程序  21-22
    2.2.2 家蚕ABC 转运子的鉴定  22
    2.2.3 家蚕ABC 转运子的序列分析  22
  2.3 结果与分析  22-30
    2.3.1 家蚕ABC 转运子的鉴定分析  22-28
    2.3.2 家蚕 ABC 转运子的序列分析  28-30
  2.4 本章小结和讨论  30-31
第3章家蚕ABCB 亚族基因Abcb6 的克隆、组织表达及序列分析  31-50
  3.1 引言  31
  3.2 材料与方法  31-41
    3.2.1 宿主菌、载体、酶  31-32
    3.2.2 常用试剂和缓冲液的配制  32-33
    3.2.3 主要实验仪器和设备  33
    3.2.4 生物信息学分析软件  33
    3.2.5 BmAbcb6 基因的电子克隆和引物设计  33-34
    3.2.6 总RNA 提取和第一链cDNA 合成  34-35
    3.2.7 PCR 扩增和产物的回收  35-37
    3.2.8 目的片段的连接和质粒DNA 的转化  37-38
    3.2.9 重组质粒的菌液PCR 鉴定  38-39
    3.2.10 碱裂解法少量提取质粒DNA  39
    3.2.11 重组质粒的酶切鉴定  39
    3.2.12 甘油菌的制备及序列测定  39-40
    3.2.13 BmAbcb6 生物信息学分析  40
    3.2.14 BmAbcb6 在5 龄第3 天幼虫不同组织中的表达谱  40-41
  3.3 结果与分析  41-48
    3.3.1 BmAbcb6 的电子克隆与验证  41
    3.3.2 BmAbcb6 基因ORF 的克隆及序列测定  41-42
    3.3.3 BmAbcb6 相关生物信息学分析  42-48
    3.3.4 家蚕5 龄第3 天幼虫不同组织中BmAbcb6 的表达谱  48
  3.4 本章小结和讨论  48-50
第4章家蚕Bmwh2 的克隆、组织表达及功能研究  50-61
  4.1 引言  50-51
  4.2 材料与方法  51-54
    4.2.1 材料和设备  51
    4.2.2 Bmwh2 基因ORF 的克隆及序列测定  51-52
    4.2.3 总RNA 提取和第一链cDNA 合成  52
    4.2.4 PCR 扩增和产物的回收  52-53
    4.2.5 目的片段的连接和质粒DNA 的转化  53
    4.2.6 快速细胞破碎法鉴定重组质粒  53
    4.2.7 碱裂解法少量提取质粒DNA  53
    4.2.8 重组质粒的酶切鉴定  53
    4.2.9 甘油菌的制备及序列测定  53
    4.2.10 Bmwh2 生物信息学分析  53
    4.2.11 Bmwh2 在5 龄第3 天幼虫不同组织中的表达谱  53-54
    4.2.12 家蚕Bmwh2 干涉序列的制备  54
    4.2.13 蚕卵准备及显微注射  54
    4.2.14 注射后的siRNA 表型观察  54
  4.3 结果与分析  54-59
    4.3.1 Bmwh2 基因ORF 的克隆及序列测定  54-55
    4.3.2 Bmwh2 基因的生物信息学分析  55-57
    4.3.3 家蚕5 龄第3 天幼虫不同组织中Bmwh2 的表达谱  57-58
    4.3.4 Bmwh2 siRNA 对蚕卵表型的影响  58-59
  4.4 本章小结和讨论  59-61
结论  61-63
参考文献  63-70
攻读学位期间发表及待发表的学术论文  70-71
致谢  71-72
详细摘要  72-76

家蚕三磷酸腺苷结合盒转运子的鉴定及部分成员的克隆与功能分析

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