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黄瓜根际土壤细菌种群及酮基合酶基因多样性与黄瓜枯萎病发病关系研究

作　者: 胡英畅
导　师: 刘志恒；刘秋
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 黄瓜枯萎病根际土壤放线菌种类细菌种群酮基合酶多样性
分类号: S436.421
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文对黄瓜根际土壤中细菌种群以及酮基合酶基因(KS)多样性与枯萎病的发病关系进行了研究。试验利用传统的分离培养方法、PCR-DGGE技术和分子克隆技术,针对黄瓜不同根际土壤样品的微生物种群以及编码聚酮类化合物的酮基合酶(KS)’基因多样性,研究了二者与黄瓜枯萎病发病的相关性。试验比较分析了发病程度不同的黄瓜根际土壤样品中微生物种群和KS基因的多样性。采用PCR-DGGE技术,分析了发病程度不同的黄瓜根际土壤样品中微生物种群的多样性,结果表明,罹病黄瓜植株根际土壤中细菌种群数量明显高于未发病黄瓜根际土壤,这与以往报道的未发病黄瓜根际土壤微生物种群数量更为丰富的结论并不一致。同时采用目的基因片段克隆及序列分析技术,分析了发病程度不同的黄瓜根际土壤中KS基因的多样性,结果表明,罹病黄瓜根际土壤中KS基因更为丰富。此结果与土壤中细菌种群多样性的分析结果趋于一致。试验自行设计了不同土壤样品中生物基因组总DNA的提取方法——碱裂解法,并与其他3种DNA提取的方法进行了比较。结果表明,碱裂解法使用醋酸钾和氯化镁去除腐殖酸等杂质,可以获得高质量、大片段、高完整性的DNA,从而为后期实验提供了良好的’DNA模板,对于PCR扩增和后续的分子操作更为适用。试验证明,碱裂解法是自主创新的DNA提取的有效方法,该方法已经申请了专利(申请号：2010101032923)。试验利用传统的常规分离方法,从发病程度不同的黄瓜根际土壤样品中分离培养获得放线菌。对各土壤样品中分离获得的拮抗放线菌不同种类的数量差异进行了比较,结果显示,感染黄瓜枯萎病的根际土壤中拮抗放线菌的种类多于未感染枯萎病的土壤。试验采用PCR-DGGE方法,以特殊的带有"GC夹板”的引物,分析了发病程度不同的黄瓜根际土壤中细菌种群的变化,该方法大大提高了DGGE的检出率。通过对种植前、接菌前、罹病、未发病4种黄瓜根际土壤样品中细菌种群的变化分析,结果表明,罹病黄瓜根际土壤中细菌的种群更为丰富。利用Ⅰ型聚酮合酶基因的简并引物,对提取的罹病和未发病根际土壤中的总DNA进行PCR扩增,并进行克隆测序,共获得KS基因205个,全部提交GenBank并获得登录号,供同类研究使用。对测序获得的KS基因数目统计分析结果表明,从罹病土壤样品中获得了更多的阳性克隆子,显示出了更为丰富的KS基因多样性,该结果与PCR-DGGE对土壤中细菌种群多样性的分析结果趋势一致。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
前言  11-12
第一章土壤微生物多样性及聚酮类化合物研究进展  12-30
  1.1 土壤微生物多样性研究进展  12-24
  1.2 土壤微生物总DNA提取方法研究进展  24-27
  1.3 聚酮类化合物及聚酮合酶基因簇研究进展  27-30
第二章土壤中总DNA提取方法研究  30-45
  2.1 材料与方法  30-38
  2.2 结果与分析  38-42
    2.2.1 土壤样品理化性质测定结果  38
    2.2.2 土壤样品总DNA提取方法评估  38-42
  2.3 小结与讨论  42-45
第三章黄瓜根际土壤拮抗放线菌的筛选  45-52
  3.1 材料与方法  45-47
  3.2 结果与分析  47-51
    3.2.1 黄瓜的种植及接种  47
    3.2.2 黄瓜根际土壤中放线菌的分离  47-48
    3.2.3 土壤中放线菌的初筛  48-49
    3.2.4 土壤中放线菌的抑菌活性  49-51
  3.3 小结与讨论  51-52
第四章黄瓜根际土壤细菌种群多样性分析  52-60
  4.1 材料与方法  52-55
  4.2 结果与分析  55-58
    4.2.1 土壤样品总DNA提取结果  55-56
    4.2.2 PCR扩增结果  56
    4.2.3 土壤中细菌16Sr DNA V3区DGGE结果  56-58
  4.3 小结与讨论  58-60
第五章黄瓜根际土壤中KS基因的多样性研究  60-75
  5.1 材料与方法  60-64
  5.2 结果与分析  64-74
    5.2.1 土壤样品总DNA的提取  64
    5.2.2 土壤样品中Ⅰ型聚酮合酶功能基因的PCR扩增结果  64-65
    5.2.3 克隆插入片段的PCR检测结果  65-67
    5.2.4 序列分析  67-74
  5.3 小结与讨论  74-75
第六章结论  75-78
参考文献  78-86
致谢  86-87
攻读学位论文期间发表的学术论文目录  87

黄瓜根际土壤细菌种群及酮基合酶基因多样性与黄瓜枯萎病发病关系研究

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