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PRRSV GP5蛋白基因重组牛痘病毒的构建及免疫学初步研究

作　者: 田野
导　师: 张守发
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV GP5 重组牛痘病毒 Prime boost免疫策略
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 32次
引　用: 1次
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒引起的猪的一种高度传染病,主要以妊娠母猪发生早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱胎及各年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。自1987年美国首次发现以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,给世界养猪业造成了严重经济损失,因此国际兽疫局将其列为B类传染病,我国将其列为二类传染病。GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白,可诱导产生中和抗体,因此GP5蛋白基因是研究PRRSV新型疫苗的主要目的基因。本研究根据PRRSV基因组GP5基因序列,设计合成三对引物,应用RT-PCR扩增PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将目的片段克隆至pMD-18T载体,亚克隆构建三种质粒,分别为真核表达质粒pcDNA3.1-GP5和原核表达质粒pGEX-GP5、穿梭质粒pSC11-GP5。WR株牛痘病毒(CPV)感染TK143细胞后,用pSC11-GP5转染TK~-143细胞,与牛痘病毒进行同源重组。在含有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,最终获得了含有PRRSV GP5基因的重组牛痘病毒(rWR-PRRSV-GP5)。分别以rWR-PRRSV-GP5、pcDNA3.1-GP5免疫小鼠,分离血清,以原核表达质粒pGEX-GP5表达的蛋白为抗原,进行间接ELISA检测,结果显示所构建的重组牛痘病毒rWR-PRRSV-GP5与真核表达质粒pcDNA3.1-GP5在小鼠体内可诱导特异性抗体产生。同时应用Prime boost免疫策略免疫小鼠,ELISA结果表明这种免疫方法所产生的特异性抗体水平明显高于单一免疫,这为新型疫苗的和Prime boost免疫策略的应用奠定了基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-10
1 前言  10-21
  1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)概述  10-11
  2 PRRSV的主要结构蛋白  11-13
    2.1 GP5蛋白  11-12
    2.2 M蛋白  12
    2.3 N蛋白  12-13
  3 PRRSV免疫学研究进展  13-15
    3.1 体液免疫  13-14
    3.2 细胞免疫  14
    3.3 免疫抑制  14-15
  4 PRRS疫苗研究进展  15-19
    4.1 PRRS灭活疫苗  15
    4.2 PRRS弱毒疫苗  15
    4.3 PRRS亚单位疫苗  15-16
    4.4 PRRS活病毒载体疫苗  16-18
    4.5 PRRS核酸疫苗  18-19
  5 Prime boost免疫策略  19-20
  6 本研究的目的与意义  20-21
2 试验研究  21-49
  1 试验材料  21-25
    1.1 病毒和细胞  21
    1.2 质粒、菌种与实验动物  21
    1.3 主要试剂  21
    1.4 主要溶液及培养基的配置方法  21-23
    1.5 主要仪器设备  23-24
    1.6 引物的设计与合成  24-25
  2 试验方法  25-38
    2.1 GP5基因的克隆  25-27
    2.2 GP5蛋白的原核表达  27-29
    2.3 GP5蛋白的真核表达  29-30
    2.4 GP5基因重组牛痘病毒活载体的构建  30-34
    2.5 应用Prime boost策略免疫Babl/c小鼠  34-38
  3 试验结果  38-45
    3.1 GP5基因克隆载体的构建  38-39
    3.2 原核表达质粒pGEX-GP5的鉴定  39
    3.3 原核表达质粒pGEX-GP5的表达与纯化  39-40
    3.4 GP5蛋白的Western blot鉴定  40-41
    3.5 真核表达质粒pcDNA3.1-GP5的鉴定  41
    3.6 真核表达GP5蛋白的间接免疫荧光鉴定  41-42
    3.7 pSC11-GP5的构建与正反向鉴定  42
    3.8 rWR-PRRSV-GP5的筛选  42-43
    3.9 rWR-PRRSV-GP5的PCR鉴定  43
    3.10 rWR-PRRSV-GP5的IFA鉴定  43-44
    3.11 rWR-PRRSV-GP5的Western blot鉴定  44
    3.12 ELISA抗体检测结果  44-45
  4 讨论  45-48
  5 结论  48-49
参考文献  49-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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