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TIM4对小鼠食物过敏模型中抗原特异性Th2细胞分化的影响

作　者: 杨慧敏
导　师: 郑鹏远
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: TIM蛋白树突状细胞 Th2细胞食物过敏金黄色葡萄球菌肠毒素B 卵清蛋白
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景随着新型抗生素和疫苗的发展及其在临床上的应用,感染性疾病的治疗已取得巨大成功,但在过去的几十年,过敏性疾病却呈现出明显上升趋势,大约15%-20%的人对外源抗原产生1gE介导的过敏反应,其中约有2%-6%的人存在食物过敏(food allergy, FA)及相关症状。近年虽然过敏性疾病成为研究热点且已有较多的研究,但是过敏性疾病的发病机制及病因学仍不清楚,其治疗方法有限且效果不佳。研究显示树突状细胞(dendritic cell, DC)和Th2细胞在过敏免疫反应中具有关键作用。DC是机体内功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),也是唯一能激活初始T细胞的APC, DC捕获和加工外源性抗原,并递呈抗原信息给T细胞,激活T细胞介导的免疫反应。成熟的DC高表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子、共刺激分子如CD80和CD86等协助抗原信息的递呈,有效活化T细胞。初始CD4+T细胞被激活后分化为Th1、Th2. Th17或Treg细胞,Th2细胞主要释放细胞因子IL-4、IL-5和IL-13。这些细胞因子不仅在诱导B细胞产生抗原特异性IgE中起重要作用,而且在粘液分泌、肌肉收缩、和嗜酸性粒细胞增多中起重要作用。当再次暴露于特异性抗原后,IgE交叉连接激活肥大细胞释放过敏性介质,促发过敏性反应和产生过敏性临床症状。因此Th2细胞的极化是食物过敏免疫机制中重要一步。T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin and mucin domains, TIMs)基因家族是一组新的细胞表面蛋白家族。已发现TIMs基因家族在小鼠中包括8个成员(TIMs 1-8)和在人类中3个成员(TIM1,3和4)。研究显示TIMs在过敏性疾病和自身免疫性疾病中起重要的调节作用。其中TIM4表达于APC,尤其是成熟的DC, TIM1表达于T细胞,特别是Th2细胞,近来发现它们是T细胞重要的调节因子。体外研究显示DC中TIM4蛋白的表达与自身免疫性疾病的严重程度正相关,TIM4结合TIM1共同促进T细胞的增殖,且提示TIM4可能作为一个新的分子来调节T细胞反应。我们前期研究,显示在过敏小鼠中存在Treg细胞功能不全,TIM4与TIM1的相互作用可降低Treg细胞的功能及状态,破坏免疫耐受平衡。但是TIM4对食物抗原特异性Th2细胞分化的影响研究甚少,体外实验证据不多,其机制仍需进一步研究。我们推测微生物产物和食物抗原共同作用能够导致FA,其中TIM4与其受体的相互作用可能导致Th1/Th2细胞失衡和免疫耐受的打破,是引起FA的关键。本研究将通过体外培养BMDC,与CD4+T细胞共同培养来研究微生物产物和食物抗原对CD4+T细胞的影响,并应用TIM4抗体干预,探讨TIM4在FA发病过程中的作用,从而进一步了解食物过敏发生的分子机制,并为临床治疗提供理论依据。目的通过检测TIM4 mRNA的表达,DC表面分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表达,研究微生物产物对TIM4的作用和微生物产物对DC的刺激作用。使用SEB和OVA共同作用于BALB/c小鼠,分离过敏小鼠脾脏CD4+T细胞,和DC在不同条件下共同培养,检测细胞上清液中Th1/Th2细胞因子的水平。探讨在微生物产物参与的食物过敏(food allergy, FA)中TIM4对CD4+T细胞分化的影响。方法培养BALB/c小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived DC, BMDC),培养的DC分为两组：金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激组和空白对照组。使用SEB和OVA致敏BALB/c小鼠,取过敏模型小鼠脾脏CD4+T细胞,和DC细胞共同培养分为5组：空白对照组、SEB+卵清蛋白(OVA)共同作用组、SEB组、OVA组及TIM4抗体干预组。进行相关指标的检测。1. RT-PCR检测DC的TIM4 mRNA表达。2.流式细胞仪检测DC表面CDIIcn MHC-Ⅱ、CD86的表达。3. ELISA法测定混合培养细胞上清液IL-4与IFN-y的表达。所得数据均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。组间均值比较采用单因素方差分析,以a=0.05为假设检验标准。结果1.体外分离骨髓细胞,诱导分化为树突状细胞,通过流式细胞仪检测特征性标志CDllc纯度可达70%,并具有特征性形态。2.使用SEB刺激DC,与空白对照组相比,SEB刺激组DC TIM4 mRNA表达明显增高(0.941±0.018 vs 0.422±0.083,均P<0.05),并具有剂量依从性。3.使用SEB刺激DC,流式细胞仪检测：SEB刺激组DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达明显高于空白对照组(MHC-Ⅱ：76.684%±3.1803% vs 52.984%±3.6026%,P=0.000；CD86：89.746%±2.113%vs 67.558%±0.4341%,P=0.000)。4.DC和CD4+T细胞共同培养中,相比对照组,SEB+OVA组IL-4表达显著增高(295.834±20.408 vs 78.335±13.109,均P<0.05),而IFN-γ的表达明显减少(362.109±92.271 vs 761.897±102.967,均P<0.05)；SEB组或OVA组IL-4和IFN-γ与空白对照组无明显差异；DC和CD4+T细胞共同培养中应用TIM4抗体干预后,结果显示对比SEB+OVA组IL-4明显降低,而IFN-γ的表达明显增高(P均<0.05),与对照组、SEB组和OVA组相比两种细胞因子的表达无统计学差异。结论1.SEB刺激DC增加TIM4的表达。2.SEB刺激DC促进DC上MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表达上调,促进DC功能成熟。3.SEB和OVA共同刺激促进CD4+T细胞分化为Th2细胞,共同导致食物过敏。单一的SEB或者OVA不能引起食物过敏反应。4.TIM4抗体干预抑制Th2细胞分化,有效纠正Th1/Th2细胞失衡,治疗食物过敏,显示TIM4在食物过敏反应中起重要作用。

全文目录

摘要  5-9
Abstract  9-15
前言  15-18
材料与方法  18-28
结果  28-31
讨论  31-38
结论  38-39
附图  39-41
参考文献  41-45
树突状细胞和T细胞免疫应答  45-66
  参考文献  58-66
中英文缩略词对照表  66-67
在学期间发表的学术论文  67-68
致谢  68

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