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利用群体感应机制筛选生防细菌及其特性的初步研究

作　者: 黄华平
导　师: 易克贤；黄俊生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 群体感应生防细菌抑菌物质鉴定 16S rDNA PCR
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

群体感应(Quorum sensing)是细菌检测自身群体密度大小的环境信号感受系统,在细菌细胞间信息交流中具有极其重要的作用。Quorum sensing作为细菌中一种普遍存在的调控系统,能参与多种生物功能的调节,包括细菌生物发光、毒力基因的表达、抗生素的产生、胞外酶的合成、胞外多糖的合成、Ti质粒的结合转移、生物膜的形成等。本研究的目的就是利用这一调控机制,建立一套能够高效、简便的模型来筛选高防效的生防细菌,并对筛选到的生防细菌进行特性研究。本研究中,从海南的13个县(市)的39个点采集了154份土样,从这些土样中,分离纯化到了1511株细菌,并用甘油冷藏法保存,建立起了一个种类丰富的细菌库。利用PCR等分子生物学技术,从1511株细菌中筛到了62株Ⅰ类生防细菌(具有aiiA基因的细菌)和42株Ⅱ类生防细菌(具有ahlI基因的细菌)。从牛津杯抑菌法试验结果来看,Ⅰ类生防细菌对欧文氏杆菌有较强的抑菌活性,有36株抑菌圈直径大于1cm,DZ122菌株的抑菌圈最大,达到1.84cm;Ⅱ类生防细菌对香蕉尖孢镰刀菌有较强的抑菌活性,有25株抑菌圈直径大于1cm,DFL059菌株的抑菌圈直径最大,达到2.41cm。通过形态学观察,生理生化试验和16S rDNA部分核苷酸序列分析,对菌株DZ122、DFL059进行了初步鉴定,结果表明DZ122菌株属于芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌,DFL059菌株属于假单胞菌属的荧光假单胞菌。本试验,研究了温度、培养液初始PH值、装料量、转速、接种量及培养基成分对菌株DZ122和DFL059发酵的影响。结果显示,DZ122菌在温度37+1℃,培养液初始PH值6～7,转速200r/min,接种量3%(v/v)的条件下,以葡萄糖为碳源,NH4Cl为氮源,C/N为16～20(m/m),于300ml/500ml的三角瓶中发酵20小时最佳,抑菌效果最好;而DFL059菌在温度37+1℃,培养液初始PH值7～8,振荡转速160r/min,接种量1%(v/v)的条件下,以蔗糖为碳源,以NH4NO3为氮源,C/N为24～28(m/m),于50ml/500ml的三角瓶中发酵28小时最佳,抑菌效果最好。对DZ122及DFL059菌的粗提物进行定性研究,结果表明DZ122菌中起抑菌作用的物质对蛋白酶K敏感,也不具热稳定性,而DFL059则相反,可以推测DZ122抑菌物质为蛋白酶类物质,而DFL059则是一些非蛋白类物质。大棚随机区组试验表明,DZ122活菌防治大白菜软腐病有一定的效果,但其总粗提物防病效果较差,而DFL059活菌和总粗提物防治香蕉枯萎病都具有较好的效果。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 前言  9-22
  1.1 群体感应机制  9-16
    1.1.1 群体感应的定义  9-10
    1.1.2 群体感应现象的发现  10
    1.1.3 已发现的quorum-sensing 系统  10-12
    1.1.4 QS 系统的调控机制  12-16
  1.2 QUORUM SENSING 的生物功能  16-19
    1.2.1 Quorum sensing 调节植物病原菌与寄主的互作  17
    1.2.2 Qurorum sensing 调节有益微生物与寄主的互作  17-18
    1.2.3 AHLs 调控系统与生物防治  18-19
  1.3 生防细菌的研究进展  19-22
    1.3.1 Bacillus 属细菌  19-20
    1.3.2 Pseudomonas 属细菌  20
    1.3.3 生防细菌的特点  20-21
    1.3.4 生物细菌的分类和鉴定的方法  21-22
2 材料与方法  22-43
  2.1 试验材料  22-24
    2.1.1 土壤样品  22
    2.1.2 病原菌  22
    2.1.3 香蕉、大白菜品种与农药  22-23
    2.1.4 主要培养基  23
    2.1.5 主要试剂、酶和缓冲液  23
    2.1.6 主要仪器设备  23-24
    2.1.7 引物合成与DNA 测序  24
  2.2 试验方法  24-43
    2.2.1 筛选模型的建立  24
    2.2.2 土壤采集  24
    2.2.3 细菌的分离  24-25
    2.2.4 细菌DNA 提取方法的比较  25-26
    2.2.5 生防细菌的筛选  26-28
    2.2.6 与病原菌的拮抗作用  28-29
    2.2.7 DZ122，DFL059 培养特征观察  29-30
    2.2.8 DZ122，DFL059 的生理生化特征研究  30-32
    2.2.9 DZ122，DFL059 的分子鉴定  32-37
    2.2.10 DZ122，DFL059 菌株产生抗菌物质最佳发酵条件研究  37-39
    2.2.11 DZ122，DFL059 粗提液拮抗活性研究  39-40
    2.2.12 DZ122 大棚防治试验  40-41
    2.2.13 DFL059 大棚防治试验  41-43
3 结果与分析  43-61
  3.1 筛选模型的建立  43-44
  3.2 菌株的分离结果  44
  3.3 细菌GDNA 提取方法比较  44-45
  3.4 生防细菌筛选结果  45-47
  3.5 菌株鉴定  47-52
    3.5.1 DZ122，DFL059 培养特征观察  47-48
    3.5.2 DZ122，DFL059 的生理生化特征  48-49
    3.5.3 DZ122，DFL059 的分子鉴定  49-52
  3.6 DZ122，DFL059 最适生长条件研究  52-58
    3.6.1 DZ122、DFL059 的生长动态变化  52-53
    3.6.2 温度的影响  53-54
    3.6.3 初始PH 值的影响  54
    3.6.4 装料量的影响  54-55
    3.6.5 转速的影响  55
    3.6.6 接种量的影响  55-56
    3.6.7 最佳碳源  56
    3.6.8 最佳氮源  56-57
    3.6.9 最佳C/N 比  57-58
  3.7 DZ122、DFL059 菌发酵液粗提物的研究  58-60
    3.7.1 蛋白酶K 对粗提液稳定性的影响  58-59
    3.7.2 温度对粗提液稳定性的影响  59-60
  3.8 大棚试验  60-61
4 讨论  61-64
  4.1 生防细菌的筛选方法  61-62
  4.2 生防细菌防治病害的潜力  62
  4.3 生防细菌菌株的鉴定  62
  4.4 生防细菌发酵条件的研究  62
  4.5 存在的问题  62-64
5 结论  64-65
6 附图  65-67
参考文献  67-73
致谢  73

利用群体感应机制筛选生防细菌及其特性的初步研究

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