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瑞拉菌素产生菌GAO-1-GR-2发酵工艺优化及活性产物提取工艺研究

作　者: 程建坤
导　师: 安德荣
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植保资源利用
关键词: 链霉菌 发酵 农用抗生素 效价 大孔吸附树脂 纯化
分类号: TQ920.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


为进一步提高瑞拉菌GAO-1-GR-2菌株的效价,对其发酵条件和活性物质的提取工艺进行优化,为工业化生产作了准备。瑞拉菌GAO-1-GR-2菌株是以委内瑞拉链霉菌新变种RL-2 (Streptomyces venezuelaevar. Qinlingensis RL-2)为基础,以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET152和复制型pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli) ET12567 (pUZ8002)进行属间接合转移瑞拉菌素产生菌获得的高发酵效价的工程菌株。本实验对瑞拉菌GAO-1-GR-2的发酵条件进行了单因素研究,通过正交试验设计对该菌株的培养基进行了筛选。并对其发酵条件进行了研究,结果表明：有机氮源以酵母粉和黄豆饼粉为宜；碳源以葡萄糖和饴糖最好,但考虑到发酵成本,应选用葡萄糖2%。发酵培养基应呈中性,以采用自然pH为宜,pH超过8,或小于7,则会抑制发酵产物活性；通气量为1：0.5最好,能降低20%耗氧量；摇床转速140r/min,培养温度30℃,发酵周期72h。抗生素发酵原粉效价能达到4000μg/m1。瑞拉菌GAO-1-GR-2活性产物粗提物有较广的抑菌谱,对多种病原菌有较强的抑制作用,尤其对水稻稻瘟、小麦赤霉、小麦根腐、烟草赤星等病原真菌及十字花科软腐等细菌抑制率较高,lmg·L-1药剂浓度的抑制率都在65%以上,这为广谱性生物农药的研制提供了理论依据。以瑞拉菌素高产菌GAO-1-GR-2发酵液为基础,选用不同的粗提温度和5种不同的大孔吸附树脂提取瑞拉菌素高产菌GAO-1-GR-2抑菌活性物质,以稻瘟菌为指示菌,进行吸附条件优化。结果表明,最佳粗提温度为60℃GAO-1-GR-2抑菌活性物质活性最强且提取效率最高,HP-20对活性物质的吸附效果较好,并且获得了较优的吸附条件：上样液pH为6.0,最佳的吸附流速为2.OmL·mi-1,最佳的洗脱液为体积分数50%的甲醇、70%的乙醇和30%的丙酮,洗脱液最佳流速为1.5mL·min-1

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
引言  12-13
第一章 文献综述  13-24
  1.1 生物农药的研究及应用  13-16
    1.1.1 生物农药简介  13
    1.1.2 微生物源农药的研究及应用  13-15
    1.1.3 动物源农药的研究及应用  15
    1.1.4 植物源农药的研究及应用  15-16
  1.2 农用抗生素的研究及其产生菌  16-17
    1.2.1 农用抗生素的发展历程  16
    1.2.2 农用抗生素的产生菌  16-17
  1.3 微生物发酵过程  17-20
    1.3.1 抗生素发酵有关的参数  17-19
    1.3.2 发酵过程的代谢变化  19-20
  1.4 抗生素的分离提取  20-23
    1.4.1 发酵液的预处理  20
    1.4.2 抗生素的提取  20-22
    1.4.3 抗生素的精制  22-23
  1.5 抗生素的应用前景与发展趋势探讨  23-24
第二章 材料和方法  24-28
  2.1 材料  24
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 供试病原菌  24
  2.2 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵条件优化  24-25
    2.2.1 摇瓶试验  24
    2.2.2 发酵培养基中无机氮源试验  24
    2.2.3 葡萄糖代用品试验  24
    2.2.4 初始pH的影响  24
    2.2.5 通气量试验  24-25
    2.2.6 恒温摇床转速对目的菌生长的影响  25
    2.2.7 温度对GAO-1-GR-2菌生长的影响  25
  2.3 高产菌株GAO-1-GR-2活性物质的提取  25-26
    2.3.1 发酵液的预处理  25
    2.3.2 有机溶剂溶媒萃取法提取GAO-1-GR-2菌株活性成分  25
    2.3.3 大孔吸附树脂在GAO-1-GR-2菌株活性成分提取中的应用  25-26
  2.4 活性产物对病原菌孢子萌发的影响  26-27
  2.5 抗生素效价的生物测定  27-28
第三章 结果与分析  28-40
  3.1 发酵条件的优化  28-32
    3.1.1 有机氮源的确定  28-29
    3.1.2 发酵培养基中无机氮源试验  29
    3.1.3 葡萄糖代用品试验  29-30
    3.1.4 初始pH的影响  30
    3.1.5 通氧气量试验  30-31
    3.1.6 转速对目的菌生长的影响  31-32
    3.1.7 温度对GAO-1-GR-2菌生长的影响  32
  3.2 高产菌株GAO-1-GR-2活性物质的提取工艺结果  32-33
    3.2.1 有机溶剂溶媒萃取法提取GAO-1-GR-2菌株活性成分的结果  32-33
  3.3 大孔吸附树脂在GAO-1-GR-2菌株活性成分提取中的应用  33-40
    3.3.1 不同浓缩温度对活性物质的影响  33
    3.3.2 吸附树脂的选择  33-34
    3.3.3 不同pH对HP-20树脂吸附的影响  34
    3.3.4 洗脱液筛选结果  34-35
    3.3.5 不同浓度稀释液对HP-20树脂吸附的影响  35
    3.3.6 吸附流速的筛选结果  35-36
    3.3.7 洗脱液流速对解吸的影响  36
    3.3.8 GAO-1-GR-2抗真菌活性产物对孢子萌发的影响  36-39
    3.3.9 抗生素效价的生物测定  39-40
第四章 结论与讨论  40-43
  4.1 结论  40
    4.1.1 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵条件的优化  40
    4.1.2 瑞拉菌GAO-1-GR-2发酵液活性物质的提取  40
  4.2 讨论  40-43
    4.2.1 瑞拉菌发酵条件的优化  40-41
    4.2.2 关于活性物质提纯方案  41-43
参考文献  43-47
附件  47-50
致谢  50-51
作者简介  51

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 发酵工艺
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