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猪RGS2和Gαq/11基因的克隆、定位及其生物特性研究

作　者: 姚文书
导　师: 杨在清
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 猪 RGS2基因 Gaq/11基因基因克隆组织表达谱染色体定位
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

脂肪细胞是由中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中，能分化为脂肪细胞、造骨细胞和软骨细胞。目前脂肪细胞分化的中晚期调控机理相对较清楚，但脂肪细胞分化早期调控的分子机理十分复杂，且报道甚少。 G蛋白信号转导调节子2(RGS2)是动物机体中神经、激素及外界信号刺激转导的重要信号分子，它作为G蛋白分子开关，在广泛地协调胞外刺激应答中起着重要的作用。最近的研究表明，RGS2是脂肪细胞早期分化的重要调控因子；在对小鼠皮下前脂肪细胞分化研究时发现，在所有G蛋白alpha亚基中只有Gaq／11的表达量显著减少，提示可能Gaq／11在前脂肪细胞分化中起重要作用。RGS2直接参与Gaq的作用，因此两者的协同作用可能与脂肪细胞早期分化调控有关。本研究在已知人RGS2、Gaq／11基因序列的基础上，采用电子克隆和同源序列法相结合的方法，克隆了猪RGS2、Gaq／11 cDNA(GenBank No：DQ150111，DQ319976、DQ256410)。参考人和鼠RGS2基因序列，在已获得的cDNA序列上设计引物，扩增内含子，获得RGS2基因组序列(GenBank No：DQ2856600)。序列分析发现这三个基因编码区在人、猪之间的同源性很高94-100％，特别是Gaq，在人、猕猴、小鼠、大鼠、南美负鼠和猪上的氨基酸序列完全相同；RGS2基因结构与人、鼠相同，且内含子两端都符合GT／AG规则。采用猪辐射杂种板技术，对三个基因进行了染色体精细定位，分别定位在猪10p、1q21-27和2q21-24。三个基因所在的猪染色体区域与基因在入相应的染色体位置相一致。用半定量PCR的方法，对三个基因进行了组织表达谱分析。三个基因在组织中的表达范围都很广泛。RGS2基因在猪的肌肉、肝、心、脾、肺、脂肪组织、脑、子宫组织中均有表达，在肾、胃和肠中没有检测到表达，其中在脂肪、肌肉和心等组织中表达量较高，在脾、肺等组织中表达量较低。Gaq和Ga11基因的表达在时空上基本一致，除在肾、肺、胃、肠组织中没有检测到其基因表达外，其他组织均能检测到表达，这两个基因表达的时空一致性可能与两者在功能上存在互补和协调有关。构建了含RGS2全长编码区为目的基因的绿色荧光表达载体，转染猪IBRS2细胞，实现了超表达，形态观察表明RGS2主要定位在细胞质。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表  9-10
1 综述  10-15
  1.1 脂肪细胞的分化及其分子机理  10-11
    1.1.1 脂肪细胞的分化  10-11
    1.1.2 脂肪细胞分化的分子机理  11
  1.2 RGS2和Gaq／11结构与功能  11-14
    1.2.1 RGS2结构与功能  11-13
    1.2.2 Gaq／11在脂质代谢中的作用  13-14
  1.3 结论  14-15
2 材料与方法  15-20
  2.1 试验材料  15-16
    2.1.1 RNA、cDNA和DNA样品  15
    2.1.2 培养基和试剂  15
    2.1.3 菌株、载体和细胞  15
    2.1.4 主要生化试剂的配制  15-16
    2.1.5 主要仪器设备  16
    2.1.6 使用的软件  16
  2.2 方法  16-20
    2.2.1 猪RGS2 cDNA、基因组克隆,染色体定位,组织表达谱分析  16-18
      2.2.1.1 RGS2 cDNA的克隆  16-17
      2.2.1.2 RGS2基因组的克隆  17
      2.2.1.3 RGS2的染色体定位  17-18
        2.2.1.3.1 内含子片断的克隆  17
        2.2.1.3.2 PCR扩增分型  17-18
      2.2.1.4 RGS2组织表达谱分析  18
    2.2.2 猪Gaq／11 cDNA的克隆、染色体定位和组织表达谱分析  18-19
      2.2.2.1 Gaq／11 cDNA的克隆  18
      2.2.2.2 Gaq／11染色体定位  18-19
    2.2.3 pEGFP-N1-RGS2载体构建和细胞转染  19-20
      2.2.3.1 绿色荧光载体pEGFP-N1-RGS2的构建  19
      2.2.3.2 pEGFP-N1-RGS2的细胞转染  19-20
3 结果与分析  20-37
  3.1 猪RGS2 cDNA和基因组DNA的克隆,定位及生物特性分析  20-26
    3.1.1 RGS2 cDNA克隆及氨基酸序列分析  20-24
    3.1.2 RGS2基因组DNA的克隆及结构分析  24
    3.1.3 RGS2基因的组织表达谱分析与染色体定位  24-25
    3.1.4 RGS2绿色荧光融合蛋白载体的构建和在IBRS2细胞中表达  25-26
  3.2 猪Gaq和Gall cDNA的克隆,定位及生物特性分析  26-37
    3.2.1 Gaq和Gall cDNA的克隆  26
    3.2.2 Gaq和Gall氨基酸序列分析  26-34
      3.2.2.1 Gaq氨基酸序列分析  26-30
      3.2.2.2 Gall氨基酸序列分析  30-34
    3.2.3 Gaq和Gall基因的组织表达谱与染色体定位  34-37
4 讨论  37-39
  4.1 基因克隆方法分析  37
  4.2 猪RGS2、Gaq／11 cDNA和RGS2基因组的克隆  37-38
  4.3 猪RGS2,Gaq／11的组织表达谱分析和染色体定位  38
  4.4 含RGS2编码区的绿色荧光载体的构建  38-39
5 结论  39-40
参考文献  40-44
研究生期间发表论文情况  44-45
致谢  45-46
附录  46-54
  附录1 猪RGS2 cDNA序列  46-47
  附录2 猪RGS2基因组序列  47-50
  附录3 猪Gaq cDNA序列  50-51
  附录4 猪Gall cDNA序列  51-52
  附录5 猪Gaq／11定位用基因组序列  52-53
  附录6 猪RGS2、Gaq／11染色体定位图  53-54
声明  54

猪RGS2和Gαq/11基因的克隆、定位及其生物特性研究

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