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甜菜夜蛾与斜纹夜蛾触角细胞色素P450及酯酶基因cDNA片段的克隆和组织表达分析

作　者: 邵刚锋
导　师: 董双林
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾斜纹夜蛾气味降解酶细胞色素P450多功能氧化酶触角酯酶组织表达谱
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

昆虫在长期进化过程中形成了高度灵敏的嗅觉系统,并以此来感受自然环境中的各种化学信息,产生相应的生理和行为反应,如寻找配偶、食物源和栖息场所、产卵行为、逃避危险或者不适合的栖息地和寄主等,因此嗅觉系统对于昆虫的生命活动至关重要。将昆虫嗅觉应用于害虫防治,已成为害虫管理的一个重要手段,并将在未来害虫治理中起到越来越重要的作用。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾是世界性分布的重要农业害虫,危害很多种粮食和蔬菜作物,生产上主要依靠化学防治,但由于害虫抗药性以及蔬菜等作物的无公害防治要求,迫切需要寻求新的防治技术。这两种夜蛾雌虫性信息素组分已得到鉴定,并成功用于田间种群的预测预报,但将性信息素直接用于害虫的大量诱杀或交配干扰,防治效果并不理想。因此,深入研究蛾类昆虫性信息素通讯的分子机制,弄清性信息素感受相关蛋白及其功能,必将有助于针对特定嗅觉蛋白设计和开发更为高效的两性通讯的调控技术,服务于蔬菜和粮食的无公害生产。本文对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角内两类气味降解相关酶类进行了研究,主要结果如下：1甜菜夜蛾P450基因的克隆、序列分析及组织表达谱分析通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的细胞色素P450氨基酸序列,设计合成一对简并性引物,利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)雄虫触角扩增得到2个分别为444bp和441bp的cDNA片段,由P450命名委员会命名为CYP4L15和CYP4L16。S. exigua的2个P450基因推导的氨基酸序列与已知其它鳞翅目昆虫P450基因具有较高的同源性,其中CYP4L15和甘蓝夜蛾CYP4L4基因相似性高达94%；CYP4L16和甘蓝夜蛾CYP4L4基因相似性高达92%。2个基因间的相似性为96%。RT-PCR结果表明,CYP4L15和CYP4L16在雌雄虫触角内均有表达,且表达量相当,说明该P450基因没有性特异性。CYP4L15基因在雄蛾各个组织中都有表达；CYP4L16除在雄蛾腹部没有明显表达外,在其它组织中均表达；两个基因在翅内的表达量均较低。根据上述结果,推测2个基因可能参与了昆虫的化学感受；而CYP4L15可能还参与对进入消化道的植物次生物质的代谢等。2斜纹夜蛾P450基因的克隆、序列分析及组织表达谱分析通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的细胞色素P450氨基酸序列,设计合成一对简并性引物,利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从斜纹夜蛾(S. litura (Fabricius))雄蛾触角扩增得到3个细胞色素P450 cDNA片段,由P450命名委员会命名为CYP4L19、CYP4L20和CYP4L21。3个基因推导的氨基酸序列与已知其它昆虫P450具有较高的同源性,CYP4L19和甘蓝夜蛾CYP4L4基因相似性达到94%；CYP4L20和甘蓝夜蛾CYP4L4基因相似性达到92%；CYP4L21和甘蓝夜蛾CYP4L4基因相似性达到92%。CYP4L19和甜菜夜蛾细胞色素P450基因CYP4L15和CYP4L16的相似性分别为97%和95%；CYP4L20和甜菜夜蛾细胞色素P450基因CYP4L15和CYP4L16的相似性分别为95%和93%；CYP4L21和甜菜夜蛾细胞色素P450基因CYP4L15和CYP4L16的相似性分别为96%和93%；3个斜纹夜蛾P450 cDNA片段间的氨基酸序列的相似性互为97%。RT-PCR结果表明3个基因在雌雄蛾触角内都有表达,且表达量相当,说明3个基因在雌雄蛾触角内担负相似的功能,并具有相似的重要性。除CYP4L21在雄蛾翅内没有表达外,3个基因在所有测定的组织中均表达,以触角、腹部和足中的表达量较高,而头、胸及翅中的表达量较低。因此,同甜菜夜蛾的2个P450基因类似,3个斜纹夜蛾P450基因可能担负对外源气味物质、食物中的有毒物质及杀虫剂的代谢作用。3甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶基因克隆、序列及组织表达谱分析设计合成一对简并性引物,在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角内分别克隆到1个长为393bp的cDNA片段,命名为SexiAE和SlitAE。SexiAE与已知其它昆虫具气味降解活性酯酶的同源性较高,其中和甘蓝夜蛾气味降解酯酶相似性最高为54%。SlitAE与已知甘蓝夜蛾气味降解酯酶和海灰翅夜蛾触角酯酶的相似性最高,均为51%,SexiAE和SlitAE相似性为67%。RT-PCR结果表明,SexiAE和SlitAE在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾雌雄触角内均有表达,且表达量相当,不具有性特异性,推测2个酯酶基因可能参与了包括性信息素组分在内的多种气味物质的降解。SexiAE在甜菜夜蛾雄虫各个组织内都有表达,但在去触角的头部较低。SlitAE在斜纹夜蛾雄虫触角、腹部表达量较高,在足内表达微弱,在其它组织内没有表达。2个基因在腹部等非化感组织的表达,说明它们可能还担负降解气味物质以外的功能。由于SexiAE较SlitAE具有更宽的组织表达谱,说明前者可能参与更多的生理功能,其底物谱也可能更宽。本文利用分子生物学技术,成功克隆出甜菜夜蛾和斜纹夜蛾几个P450基因和酯酶基因,并进行了序列及组织表达谱等相关分析。研究结果为进一步明确两种夜蛾的气味感受机制,并为研制和开发新型、高效的两性通讯阻断剂提供了依据

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摘要 6-9ABSTRACT 9-12英文缩略语 12-13第一章文献综述 13-28 1 嗅觉感器及触角感受机制 13-16 2 昆虫气味降解酶的研究进展 16-22 2.1 昆虫气味降解酶的种类及分布 17-18 2.2 昆虫气味降解酶(ODE)的作用机制 18-19 2.3 昆虫细胞色素P450概述 19-21 2.4 昆虫羧酸酯酶概述 21-22 3 甜菜夜蛾与斜纹夜蛾及性信息素研究概况 22-28 3.1 甜菜夜蛾与斜纹夜蛾的发生与危害现状 22 3.2 性信息素研究现状 22-26 3.3 本研究的目的及意义 26-28第二章甜菜夜蛾触角内2个细胞色素P450 CDNA片段的克隆和组织表达分析 28-41 1 材料与方法 29-34 1.1 供试昆虫 29 1.2 主要试剂和仪器设备 29 1.3 昆虫总RNA的提取 29-30 1.4 cDNA第一链的合成 30 1.5 PCR引物设计 30-31 1.6 PCR扩增 31 1.7 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析 31-34 1.8 组织表达分析 34 2 结果与分析 34-39 2.1 甜菜夜蛾P450基因cDNA片段的克隆与分析 34-36 2.2 P450基因的序列同源性比较 36-37 2.3 P450基因在雌雄触角内的表达差异 37-38 2.4 P450基因在雄蛾体内的组织表达谱 38-39 3 讨论 39-41第三章斜纹夜蛾触角内3个细胞色素P450 CDNA片段的克隆和组织表达分析 41-50 1 材料与方法 41-43 1.1 供试昆虫 41-42 1.2 主要试剂和仪器设备 42 1.3 昆虫总RNA的提取 42 1.4 cDNA第一链的合成 42 1.5 PCR引物设计 42-43 1.6 PCR扩增 43 1.7 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析 43 1.8 组织表达分析 43 2 结果与分析 43-48 2.1 P450 cDNA片段扩增 43-45 2.2 序列同源性比较 45-46 2.3 P450基因在雌雄蛾触角内组织表达 46-47 2.4 P450基因在雄蛾各组织内组织表达 47-48 3 讨论 48-50第四章甜菜夜蛾和斜纹夜蛾触角酯酶CDNA片段的克隆和组织表达分析 50-59 1 材料与方法 50-53 1.1 供试昆虫 50 1.2 主要试剂及主要仪器设备 50-51 1.3 昆虫总RNA的提取 51 1.4 cDNA第一链的合成 51 1.5 PCR引物设计 51 1.6 PCR扩增 51-52 1.7 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析 52 1.8 组织表达分析 52-53 2 结果与分析 53-57 2.1 酯酶基因cDNA片段的扩增 53-54 2.2 酯酶基因序列的同源性比对 54-56 2.3 酯酶基因在雌雄触角中的表达差异 56-57 2.4 酯酶基因在雄蛾各个组织中的表达谱 57 3 讨论 57-59全文总结 59-61参考文献 61-81附录 81-83致谢 83

甜菜夜蛾与斜纹夜蛾触角细胞色素P450及酯酶基因cDNA片段的克隆和组织表达分析

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