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传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆、表达及ELISA抗体检测方法的建立

作　者: 郑玲燕
导　师: 毕丁仁
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病毒 重组蛋白VP2 间接-ELISA
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 262次
引　用: 1次
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内容摘要


本研究用RT-PCR技术成功地从鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）基因组中克隆出IBDV VP2基因，并实现了在大肠杆菌中的高效表达；以纯化的IBD VP2表达抗原为包被抗原，建立了可检测血清IBD抗体的ELISA方法，为传染性法氏囊病基因工程疫苗、快速诊断试剂的研究奠定了基础。 用蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法成功提取出IBDV基因组RNA，用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白基因VP2，并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定，VP2基因全长1356bp，与GenBank中的IBDV超强毒株VP2基因序列同源性达97％以上；将VP2基因插入大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG，获得重组质粒pKG-VP2，再转化入大肠杆菌BL21 plys S，经IPTG诱导，受体菌E．coli BL21（DE3）plys S能表达结构蛋白基因VP2，经SDS-PAGE及Western blot分析，表达产物分子量约40 KDa，表达量达到菌体总蛋白的10％，且能与IBDV阳性血清发生特异性的免疫反应。 以纯化的IBDV VP2表达蛋白作为包被抗原，建立了一种检测血清中IBDV抗体的间接ELISA方法。通过对ELISA反应条件的系列测定，确定了各组分的最适工作条件：IBDV VP2表达抗原最适包被浓度为105ng／孔；被检血清的最佳稀释度为1：80，达到该稀释度时的P／N值最大，阳性与阴性分界最明显；阴阳性临界点OD450值为0.32。根据已建立的ELISA方法及最佳反应条件，检测了890份血清样品，阳性率为92.8％。结果表明，本试验建立的间接-ELISA法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点，将为我国鸡传染性法氏囊病的免疫监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
缩略词表  9-10
第一章 文献综述  10-31
  1 概述  10-11
  2 IBDV的病原学特性  11-12
    2.1 病毒学分类与结构特性  11
    2.2 理化特性  11-12
    2.3 生物学特性  12
  3 IBDV的致病机理  12-14
  4 分子生物学研究进展  14-21
    4.1 IBDV基因组结构  14-15
    4.2 病毒蛋白及其功能  15-19
    4.3 病毒抗原变异的分子基础  19
    4.4 IBDV毒力变异的分子基础  19-21
  5 IBD的诊断  21-23
    5.1 流行病学  21
    5.2 临床症状  21
    5.3 病理变化  21
    5.4 IBD诊断方法的研究进展  21-23
  6 IBD的防制  23-30
    6.1 常规疫苗免疫  24-25
    6.2 新型传染性法氏囊病疫苗研究进展  25-29
    6.3 免疫防制中存在的问题及对策  29-30
  7 结束语  30-31
第二章 传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与表达  31-54
  1 研究目的与意义  31
  2 材料与方法  31-43
    2.1 材料  31-36
      2.1.1 病毒、质粒、细菌及抗体  31
      2.1.2 工具酶及主要生物学试剂  31-33
      2.1.3 主要试剂及溶液的配制  33-36
    2.2 实验方法  36-43
      2.2.1 引物的设计与合成  36
      2.2.2 病毒的增殖、收获及纯化  36
      2.2.3 病毒RNA提取  36-37
      2.2.4 RT-PCR扩增及检测  37
      2.2.5 DNA片段的回收  37
      2.2.6 回收的目的DNA片段与克隆载体pMD18-T的连接反应  37-38
      2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  38
      2.2.8 连接产物的转化  38
      2.2.9 质粒的制备  38-39
      2.2.10 重组质粒的鉴定与序列分析  39-40
      2.2.11 重组表达质粒的构建  40-41
      2.2.12 诱导表达  41
      2.2.13 表达产物的鉴定  41-43
  3 结果与分析  43-49
    3.1 VP2基因的RT-PCR扩增结果  43
    3.2 克隆质粒的酶切鉴定  43
    3.3 序列测定分析及系统发育进化树  43-47
    3.4 表达载体的构建与鉴定  47
    3.5 表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果  47-49
      3.5.1 重组菌菌体裂解物的SDS-PAGE电泳结果  47-48
      3.5.2 Western blot分析  48-49
      3.5.3 蛋白浓度的测定  49
  4 讨论与结论  49-54
    4.1 IBDV dsRNA的提取与VP2基因的扩增  49-50
    4.2 IBDV VP2基因的克隆  50
    4.3 VP2基因原核表达载体的构建  50-51
    4.4 VP2蛋白的表达、提取与纯化  51
    4.5 包涵体的提取及溶解复性  51-53
    4.6 小结  53-54
第三章 ELISA方法的建立与临床应用  54-64
  1 研究目的与意义  54-55
  2 材料与方法  55-58
    2.1 材料  55
      2.1.1 标准血清和酶标抗体  55
      2.1.2 ELISA试剂的配制  55
      2.1.3 主要实验器材  55
    2.2 方法  55-58
      2.2.1 IBD-ELISA最佳工作条件的确定  55-57
      2.2.2 间接ELISA测定的基本实验步骤  57
      2.2.3 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定  57
      2.2.4 重复性试验  57
      2.2.5 特异性试验  57-58
      2.2.6 临床血清样品的检测  58
  3 结果与分析  58-62
    3.1 ELISA最佳条件及阴阳性界限的确定  58-61
      3.1.1 反应板均一性测定  58
      3.1.2 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定  58-59
      3.1.3 酶标抗体工作浓度的确定  59
      3.1.4 封闭液的选择及封闭时间的确定  59-60
      3.1.5 阴阳性血清反应时间的确定  60
      3.1.6 酶标二抗的作用时间的确定  60-61
      3.1.7 底物反应时间的确定  61
      3.1.8 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定  61
    3.2 重复性试验  61
    3.3 特异性试验  61-62
    3.4 临床送检血清的ELISA检测结果  62
  4 讨论与结论  62-64
参考文献  64-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
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