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IBDV弱毒株在囊B细胞上的适应分析及HeYD株的分离鉴定

作　者: 鄂巍
导　师: 王爱萍
学　校: 郑州大学
专　业: 动物学
关键词: 传染性法氏囊病毒分离鉴定细胞嗜性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)是双链RNA病毒,感染雏鸡法氏囊B淋巴细胞。经典的IBDV毒株可感染3到6周龄的雏鸡,会造成免疫缺陷,进而引起其它病原的感染,并出现高死亡率。而IBDV超强毒株(vvIBDV)可以直接使雏鸡死亡,造成巨大经济损失。同时,IBDV还可以使其它疫苗的作用大大下降。IBDV是双节段双链无囊膜RNA病毒,属于双RNA病毒科,禽类双RNA病毒属。病毒颗粒是直径约为60nm的二十面体,而且IBDV,共编码5种病毒蛋白,分别是VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。其中,VP2是IBDV的主要的结构蛋白,是IBDV含量最多,且最重要的结构蛋白,影响病毒着病毒的多项功能,对于病毒毒力和细胞嗜性有着非常重要的影响。在病毒防治方面,VP2作为主要抗原可以使机体对IBDV病毒产生保护性抗体。IBDV VP2蛋白的高变区,具有毒力特征氨基酸位点,而且存在着高度变异的可能性。本实验用的两株IBDV弱毒株TAD和HN3,通过细胞培养将病毒在细胞上传代,使病毒适应DT40,CEF细胞,获得可以稳定增殖的细胞适应毒株。RT-PCR扩增VP2蛋白高变区基因,克隆后测序,将测序结果进行相互比对,并且与一些不同毒力的代表毒株进行比对。结果表明适应毒株序列与原始毒株序列有一定差异,可能是病毒在适应细胞过程中发生的一些变异。由于VP2重要作用,且其高变区的高度变异性,本实验针对细胞适应毒株和原始毒株VP2高变区基因的核苷酸和氨基酸序列,进行比对分析,进一步了解病毒适应过程中的变异情况,进而分析出那些氨基酸残基对于病毒细胞嗜性有重要影响。本实验从GenBank中选择4株不同毒力毒株的VP2高变区基因序列,同原始毒株以及它们的适应毒株,以NJ (Neighbor Joining)法,使用MEGA 3.1构建核苷酸序列和氨基酸序列进化树,对它们的VP2高变区基因进行进化分析。使用DNAstar中的MegAlin分别对两株原始弱毒和不同细胞上的适应毒进行比对,从而清楚地了解适应过程中序列核苷酸和氨基酸变化频率及核苷酸和氨基酸位点的突变情况。结果表明DT40细胞适应毒株与原始毒株存在很小的差异,核苷酸序列差异性不超过1%,氨基酸序列差异性也不超过10%,而CEF上的适应株VP2序列完全没有变化。与原始毒株相比,DT40细胞适应毒株最都只有4个核苷酸位点发生替换,氨基酸位点最多发生3个替换。适应株发生替换的位点均不是IBDV毒力的关键位点,而且替换氨基酸不是脯氨酸一些特别氨基酸,故对蛋白质结构的影响并不是很大。而且CEF适应株VP2高变区核苷酸序列和氨基酸序列都没有发生变化,可能是VP2其它位点或其它基于发生变化引起的细胞适应。对河南新近分离的IBDV疑似超强毒株HeYD进行了基因克隆及序列分析,并与其它参考毒株高变区进行序列比对。序列分析结果表明,该分离株的VP2高变区具有IBDV超强毒株典型的氨基酸序列特征。利用VP2基因高变区序列构建基因进化树,发现HeYD毒株与国内超强毒亲缘关系较近,而与变异株和经典强毒株距离较远。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一部分前言  12-25
  1.1 IBDV的结构基因组  13
  1.2 IBDV的蛋白及其功能  13-16
  1.3 IBDV的增殖  16-17
  1.4 IBDV致病机理  17-18
  1.5 IBDV的免疫抑制  18-19
  1.6 IBDV的毒力及其超强毒株特征氨基酸位点  19-22
  1.7 VP2与毒力的关系  22-24
  1.8 DT40细胞  24
  1.9 本研究的目的及意义  24-25
第二章 IBDV弱毒株在DT40,CEF上的适应分析  25-49
  2.1 材料与方法  25-36
    2.1.1 鸡胚、细胞、毒株、菌种  25
    2.1.2 试剂  25
    2.1.3 试剂盒  25
    2.1.4 分析软件  25
    2.1.5 引物  25-26
    2.1.6 主要仪器  26
    2.1.7 病毒在DT40细胞传代及收集  26-27
    2.1.8 CEF细胞的制备  27-28
    2.1.9 病毒在CEF细胞传代及收集  28-29
    2.1.10 RT-PCR鉴定  29-35
      2.1.10.1 提取病毒总RNA  29
      2.1.10.2 反转录  29-30
      2.1.10.3 PCR扩增  30
      2.1.10.4 琼脂糖凝胶电泳  30-31
      2.1.10.5 切胶回收  31-32
      2.1.10.6 连接  32
      2.1.10.7 制备感受态细胞  32-33
      2.1.10.8 转化  33
      2.1.10.9 PCR鉴定  33-34
      2.1.10.10 质粒提取及测序  34-35
    2.1.11 VP2高变区基因进化分析  35
    2.1.12 实验毒株与参考毒株核苷酸序列比对  35
    2.1.13 分离株与参考毒株氨基酸序列的分析  35-36
  2.2 实验结果  36-47
    2.2.1 细胞培养分离病毒  36-37
      2.2.1.1 DT40细胞培养分离病毒  36
      2.2.1.2 CEF细胞培养分离病毒  36-37
    2.2.2 RT-PCR扩增电泳鉴定结果  37-38
    2.2.3 VP2高变区基因进化树  38-39
    2.2.4 适应毒株与原始弱毒株核苷酸序列相似度比对  39-41
    2.2.5 适应毒株与原始弱毒株核苷酸序列差异度比对  41-42
    2.2.6 适应毒株与原始弱毒株氨基酸序列相似度比对  42-45
    2.2.7 适应毒株与原毒株氨基酸序列差异度比对  45-47
  2.3 讨论  47-49
第三章鸡传染性法氏囊病病毒河南分离株HeYD VP2高变区基因克隆及序列分析  49-60
  3.1 材料与方法  49-55
    3.1.1 IBDV毒株  49
    3.1.2 试剂  49
    3.1.3 试剂盒、载体及感受态细胞  49
    3.1.4 引物  49
    3.1.5 主要仪器  49-50
    3.1.6 RT-PCR鉴定  50-54
      3.1.6.1 提取病毒总RNA  50-51
      3.1.6.2 反转录  51
      3.1.6.3 PCR扩增  51-52
      3.1.6.4 琼脂糖凝胶电泳  52
      3.1.6.5 切胶回收  52-53
      3.1.6.6 连接  53
      3.1.6.7 转化  53-54
      3.1.6.8 PCR鉴定  54
    3.1.7 目的基因的序列测定与分析  54-55
  3.2 结果与分析  55-58
    3.2.1 VP2基因高变区的扩增、克隆和鉴定  55-56
    3.2.2 HeYD株VP2基因高变区序列测定及分析  56-57
    3.2.3 HeYD株VP2基因高变区基因进化分析  57-58
  3.3 讨论  58-60
第四章结论  60-61
参考文献  61-68
个人简历  68-69
致谢  69

IBDV弱毒株在囊B细胞上的适应分析及HeYD株的分离鉴定

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