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SIgMλ轻链在鸡传染性法氏囊病毒感染DT40细胞中的作用研究

作　者: 游雷鸣
导　师: 王爱萍
学　校: 郑州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 传染性法氏囊病毒 SIgMλ轻链 VOPBA β-actin启动子 基因敲除载体
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是引起鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的致病病原体,主要侵害雏鸡中枢免疫器官-法氏囊,对B淋巴细胞造成损伤从而引起严重的免疫抑制。具有有表面免疫球蛋白M(surfaceimmunoglobulin M,SIgM)的B细胞是IBDV最易感的细胞。λ轻链不仅是B细胞轻链的主要类型,同时参与SIgM的形成,但其在IBDV感染过程中的作用并不清楚。为了揭示SIgMλ轻链在IBDV感染鸡法氏囊前B淋巴细胞DT40过程中的作用,本研究在分析B细胞λ轻链的序列后,从DT40细胞中克隆了λ轻链基因。构建原核表达载体pET28a-λ并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。诱导表达的λ轻链蛋白经SDS-PAGE分离后转印PVDF(polyvinylidene fluoride)膜后,利用病毒覆盖蛋白印迹技术(Virus overlay protein blot assay,VOPBA)鉴定λ轻链与IBDV的结合。为构建靶向DT40细胞SIgMλ轻链基因的基因打靶载体,转化DT40细胞建立SIgMλ轻链缺失的细胞模型,进一步探究λ轻链功能,本研究从鸡DT40细胞中克隆β-actin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建β-actin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。在对SIgMλ轻链基因进行染色体定位后,克隆其基因座位两侧各约2kb的侧翼序列并将其分别插入到抗性表达框的两侧作为同源臂,构建靶向SIgMλ轻链的基因打靶载体,并对打靶载体进行PCR、酶切和测序鉴定。VOPBA结果显示λ轻链能够与不同毒力的IBDV毒株特异结合,λ轻链在IBDV感染DT40细胞中起着结合病毒的作用,可能就是IBDV感染的受体。打靶载体的测序结果表明设计的载体序列正确符合要求,靶向SIgMλ轻链基因的打靶载体被成功构建,这为转化DT40细胞建立SIgMλ轻链基因敲除的细胞模型,深入探究SIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞中的作用奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-10
第一部分 综述鸡传染性法氏囊病的研究进展  10-14
第二部分 IBDV与SIgMλ轻链特异结合的VOPBA鉴定  14-27
  1 材料与方法  14-21
    1.1 毒株、菌株及载体  14-15
    1.2 试剂配制  15
    1.3 DT40细胞培养  15
    1.4 SIgMλ轻链基因的克隆与分析  15-18
    1.5 原核表达载体pET28a-λ的构建及鉴定  18-19
    1.6 SIgMλ轻链在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达  19-20
    1.7 IBDV与重组SIgMλ轻链特异性结合的VOPBA分析  20-21
  2 结果  21-26
    2.1 SIgMλ基因的克隆,序列分析  21-24
    2.2 重组表达载体pET28a-λ的构建  24
    2.3 融合表达蛋白分子量及等电点预测  24
    2.4 重组SIgMλ轻链蛋白的诱导表达  24-26
    2.5 重组SIgMλ轻链蛋白的western Blot鉴定  26
    2.6 重组SIgMλ轻链蛋白与不同毒力的IBDV特异结合  26
  3 讨论  26-27
第三部分 靶向DT40细胞SIgMλ轻链基因的置换型打靶载体的构建  27-37
  1 材料和方法  27-31
    1.1 材料  27-28
    1.2 DT40细胞培养  28
    1.3 β-actin启动子及SIgMλ轻链基因侧翼同源序列的克隆  28-29
    1.4 Neomycin基因部分CDS序列的克隆  29
    1.5 β-actin启动子在DT40细胞启动活性鉴定  29
    1.6 置换型打靶载体的构建  29
    1.7 打靶载体的线性化  29-31
  2 结果与分析  31-36
    2.1 鸡β-actin启动子的克隆与鉴定  31-32
    2.2 SIgMλ轻链基因侧翼同源序列的克隆分析  32
    2.3 Neomycin基因部分CDS序列的克隆  32
    2.4 β-actin启动子驱动的绿色荧光蛋白基因在DT40细胞中的表达  32-33
    2.5 SIgMλ轻链基因打靶载体pCDNA-act-neo-HR的构建结果  33-35
    2.6 打靶载体的线性化  35-36
  3 讨论  36-37
参考文献  37-41
攻读硕士期间发表的学术论文  41-42
致谢  42-43
附录  43-44

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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