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结核杆菌环介导等温扩增检测方法及间接ELISA检测方法的研究

作　者: 王正荣
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 结核杆菌 环介导等温扩增 间接ELISA 鉴别诊断
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性人畜共患病。据估计,全球约有1/3的人口被结核感染,准确、及时地对结核患者进行诊断是治疗和控制结核所必需的。结核菌素实验是临床诊断结核常用的方法,也是国际动物卫生组织与我国认可的法定检疫方法。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的抗原组份,检测时容易出现假阳性,并且此检测不能区分自然感染者与卡介苗免疫者。此外还有很多结核病的诊断方法如细菌培养、痰检、PCR、IFN-Y诊断法等,但这些方法的缺点是检测时间长,操作烦琐,需要昂贵的仪器设备,而且要有专门的人进行操作等,因此不利于结核病的检测。基于以上原因,本实验研究了两种新型的结核检测方法：一、建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法。实验根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用三种方法检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。该检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。二、采用多抗原组合的方法建立一种特异性高,灵敏度好的结核血清学诊断方法。利用分子生物学方法克隆、表达抗原蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c,并用蛋白纯化试剂盒进行纯化。将四种蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c按1：1：1：1组合,作为诊断抗原来检测血清中的结核抗体。最终以ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c作为诊断抗原建立了间接ELISA方法,并确定了ELISA诊断方法的判定标准,即S/P≥0.235为阳性,S/P<0.202为阴性,0.235>S/P≥0.202为可疑。ELISA方法的特异性为95.8.%、敏感性为65.0%。对20份痰检阳性和120份健康人血清样品进行了检测,并与痰检结果比较。20份痰检阳性血清样品中有13份为ELISA检测阳性,阳性符合率为65.0%,120份健康人血清,5份为阳性,其余为阴性,阴性符合率为95.8%,本ELISA方法与痰检诊断方法总符合率为91.4%。研究表明,ELISA方法具有很好的开发和应用前景。

全文目录


中文摘要  5-6
Abstract  6-9
主要符号表  9-10
前言  10-11
第一章 文献综述  11-38
  1. 结核病的病原学  11-13
    1.1 结核杆菌的生物学及培养特性  11-12
    1.2 结核杆菌的抗原性及致病性  12-13
  2 结核病的流行现状及趋势  13-15
    2.1 人结核病的流行现状及趋势  13-14
    2.2 牛结核病的流行现状及趋势  14-15
  3 结核病的免疫与发病机理  15-17
  4. 结核病诊断抗原的研究  17-24
    4.1 38-KDA抗原,(ANTIGEN 5,ANTIGEN 78,Rv0934)  17
    4.2 16KD抗原(Rv2031)  17-18
    4.3 MTB81(88-KD抗原,Rv1837C)  18
    4.4 ESAT-6(Rv3875)  18-19
    4.5 抗原AG85B(Rv1886C)  19
    4.6 MPT51(AG85D,27-KDA抗原,Rv3803c)  19-20
    4.7 14KD抗原(Rv0455c)  20
    4.8 MPT32(DPEP)  20-21
    4.9 A60抗原  21
    4.10 TB9.7,TB15.3,TB16.3,TB51  21-22
    4.11 HBHA,Rv0475  22
    4.12 PE和PPE抗原  22-23
    4.13 糖脂抗原  23
    4.14 融合多聚蛋白  23-24
  5. 结核病诊断方法的研究  24-31
    5.1 结核病的免疫学诊断研究  24-26
    5.2 结核病的分子生物学检测方法  26-31
  参考文献  31-38
第二章 实验研究  38-58
  实验一 结核杆菌多位点环介导等温扩增检测方法的建立  38-47
    1 材料与方法  38-41
      1.1 菌毒株及主要仪器和试剂  38-39
      1.2 引物  39
      1.3 检测样品DNA的提取  39-40
      1.4 LAMP检测方法的建立  40
      1.5 LAMP扩增反应的特异性、敏感性和准确性的检测  40
      1.6 LAMP扩增产物的酶切鉴定  40-41
    2. 结果  41-44
      2.1 引物特异性的检测  41-43
      2.2 LAMP扩增反应的灵敏度检测  43
      2.3 LAMP扩增反应临床样本符合率的检测  43-44
      2.4 LAMP扩增产物的酶切鉴定  44
    3. 讨论  44-46
    参考文献  46-47
  试验二 结核多抗原间接ELISA诊断方法的建立  47-58
    1 材料和方法  47-50
      1.1 蛋白、血清样本及主要试剂  47-48
      1.2 重组蛋白的纯化  48
      1.3 重组蛋白含量的测定  48
      1.4 纯化抗原的WESTEN BLOT分析及与其他阳性血清的血清交叉反应  48-49
      1.5 间接ELISA的操作步骤  49
      1.6 间接ELISA最佳工作条件的确定  49-50
      1.7 间接ELISA结果的判定  50
      1.8 间接ELISA特异性和敏感性试验  50
      1.9 间接ELISA检测符合率试验  50
    2 结果  50-54
      2.1 重组蛋白的纯化、WESTERN BLOT分析及血清学交叉试验  50-52
      2.2 纯化蛋白浓度的确定  52
      2.3 间接ELISA最佳工作条件的确定  52-53
      2.4 间接ELISA结果的判定  53
      2.5 间接ELISA敏感性和特异性试验  53
      2.6 IELISA检测方法与痰检结果及PPD变态反应的比较  53-54
    3. 讨论  54-56
    参考文献  56-58
结论及创新点  58-59
致谢  59-60
作者简介  60-61
导师评阅表  61

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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