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人B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达、纯化及活性研究

作　者: 梅晶晶
导　师: 张双全
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人B淋巴细胞刺激因子 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 毕赤酵母 细胞增殖
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


人B淋巴细胞刺激因子（hBAFF）是一种B淋巴细胞的共刺激因子，属TNF超家族成员。本文一方面利用巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）这一真核表达系统成功构建、表达了hBAFF蛋白；同时对毕赤酵母分泌表达得到的hBAFF进行SDS-PAGE、Western blotting、ELISA等方面的检测。另一方面将hBAFF基因通过柔性臂（Gly4Ser）2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）相连，通过大肠杆菌（E．coli）表达系统进行融合蛋白的表达；并对表达蛋白做Western blotting、荧光及B淋巴细胞增殖的活性测定。实验设计及结果如下： 1 EGFP-hBAFF融合蛋白的表达纯化及活性测定 将人B淋巴细胞刺激因子和增强型绿色荧光蛋白通过（Gly4Ser）2linker相连接，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白EGFP-hBAFF；并对该蛋白进行Ni2+-IDA亲和层析柱纯化，纯化的蛋白经检测具有EGFP的荧光活性和hBAFF的B淋巴细胞增殖活性。 2 hBAFF在毕赤酵母中的表达及产物鉴定 克隆得到hBAFF基因与穿梭载体pPIC9连接得到pPIC9-hBAFF重组质粒，线性化后电转酵母菌GS115中，挑选出阳性重组子进行诱导表达；并对表达条件优化，表达产物进行Western blotting、ELISA方面的检测。结果表明，当甲醇浓度为1％、诱导时间为72h、温度为20℃时hBAFF蛋白表达量最高。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
引言  8-9
第一部分 文献综述  9-30
  一、人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)的研究进展  10-18
    1 BAFF基因及蛋白结构  10-11
    2 BAFF的表达  11-12
    3 BAFF的受体  12
    4 BAFF的生物学功能  12-14
    5 BAFF刺激B细胞产生的胞内信号通路的研究  14
    6 在疾病中的作用  14-15
    参考文献  15-18
  二、绿色萤光蛋白综述  18-22
    参考文献  21-22
  三、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)  22-30
    1 P．pastoris宿主菌  22-23
    2 酵母表达载体  23-26
      2．1 载体的结构特点  23-24
      2．2 载体的类型  24-25
      2．3 载体的选择标志  25-26
    3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达  26-27
      3．1 异源蛋白在酵母中表达的一般步骤  26-27
      3．2 重组蛋白的翻译后修饰  27
    4 应用前景及局限性  27-29
    参考文献  29-30
第二部分 实验内容  30-73
  第一章 EGFP-hBAFF融合蛋白克隆表达、纯化鉴定及相关的活性研究  31-51
    摘要  31-32
    1 实验材料  32-33
      1．1 实验材料和试剂  32
      1．2 主要实验仪器  32
      1．3 主要试剂配制  32-33
    2 实验设计  33-34
    3 实验方法  34-40
      3．1 融合蛋白载体的构建  34-37
        3．1．1 PCR合成EGFP／hBAFF基因  34-36
        3．1．2 DNA的酶切、连接和转化  36-37
      3．2 融合蛋白的表达、鉴定和纯化  37-40
        3．2．1 融合蛋白表达  37-38
        3．2．2 显微镜观察  38
        3．2．3 融合蛋白western blotting鉴定  38-39
        3．2．4 蛋白纯化  39-40
      3．3 荧光光谱测定  40
      3．4 融合蛋白活性测定  40
    4 实验结果  40-46
      4．1 表达载体构建  40-41
      4．2 表达纯化融合蛋白  41-44
        4．2．1 阳性菌株的蛋白表达  41-43
        4．2．2 EGFP／hBAFF融合蛋白的纯化  43-44
      4．3 EGFP／hBAFF融合蛋白荧光活性测定  44-45
      4．4 融合蛋白活性测定  45-46
    5 讨论  46-48
    参考文献  48-50
    Abstract  50-51
  第二章 人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达和产物定  51-73
    摘要  51-52
    1 实验材料  52-54
      1．1 实验材料和试剂  52
      1．2 主要实验仪器  52
      1．3．主要试剂配制  52-53
      1．4 培养基的配制  53-54
    2 实验设计  54-55
    3 实验方法  55-63
      3．1 PCR合成hBAFF基因  55-56
        3．1．1 合成hBAFF基因引物序列  55
        3．1．2 PCR反应体系  55-56
        3．1．3 引物延伸条件  56
      3．2 质粒pPIC9的提取与纯化  56
      3．3 用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切质粒pPIC9,并纯化回收  56-57
      3．4 连接  57
      3．5 转化  57-58
        3．5．1 感受态细胞的制备  57
        3．5．2 连接产物的转化  57-58
      3．6 双酶切鉴定及测序  58
      3．7 宿主菌的转化  58-60
        3．7．1 质粒的提取  58
        3．7．2 质粒的线性化  58
        3．7．3 线性化质粒的纯化与鉴定  58
        3．7．4 酵母GS115宿主感受态细胞的制备  58-59
        3．7．5 电转化  59
        3．7．6 PCR鉴定阳性克隆  59-60
        3．7．7 重组菌株Mut表型鉴定  60
      3．8 重组菌株的甲醇诱导表达  60
      3．9 表达产物鉴定  60-61
        3．9．1 SDS-PAGE鉴定  60
        3．9．2 Western blotting鉴定  60-61
      3．10 表达条件的优化  61-62
      3．11 ELISA检测不同表达时间、不同温度的蛋白表达量  62-63
    4 实验结果  63-67
      4．1 hBAFF基因的扩增  63
      4．2 重组表达载体的构建  63-64
      4．3 电转化  64-65
      4．4 hBAFF蛋白的诱导表达  65-67
        4．4．1 不同诱导时间蛋白表达的SDS-PAGE  65
        4．4．2 诱导72小时后表达上清的Western blotting检测  65-66
        4．4．3 不同诱导时间和温度ELISA检测结果  66-67
      4．5 真核与原核表达量的不同  67
    5 讨论  67-69
    参考文献  69-71
    Abstract  71-73
全文总结  73-74
致谢  74-75
附1  75

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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