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SOS1 RNAi对盐芥耐盐性的影响

作　者: 马文英
导　师: 张慧；赵彦修
学　校: 山东师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: SOS1基因 Na~+/H~+逆向转运蛋白盐芥基因沉默植物耐盐性
分类号: Q945.78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

盐胁迫下,植物细胞的离子均衡受到破坏,胞质中积累过多的Na~+,对植物细胞的代谢产生毒害。植物细胞为适应胁迫环境,一方面积累可溶性有机物质;另一方面,则通过Na~+外排或者区隔化、并调整K~+/Na~+比率的机制来消除Na~+的毒害。拟南芥细胞内控制Na~+外排的基因SOS1及离子区隔化基因AtNHX1均已克隆,SOS1及AtNHX1在拟南芥中的过量表达显著提高了转基因植株的耐盐性。在拟南芥中,SOS1及SOS2、SOS3所组成的SOS信号通路的调控机制业已得到阐明,研究表明SOS信号通路在调控离子均衡和植物耐盐性中发挥重要作用。作为拟南芥近缘的盐生植物盐芥,短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化,表明其耐盐性很大程度上源于基本的生理和生化机制。因此在盐芥中沉默SOS1基因进行研究,对揭示盐生植物耐盐性的基础具有重要意义。本实验将盐芥编码Na~+/H~+逆向转运蛋白的SOS1基因721bp的片断反向重复构建到基因沉默载体pGSA1252中,导入农杆菌后,进行植物遗传转化,实现盐芥中SOS1的转录水平的下降。在用浓度为50ppm的Glufosinate ammonium筛选后,获得转基因株系,自交一代获得足够的转基因种子后,对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验。转基因植株的分子生物学检测如下:1.各转基因株系中,均能通过PCR扩增出Bar基因的500bp的特异性条带,表明T—DNA已经携带Bar基因及SOS1基因片断整合进盐芥基因组中。2. Real time PCR结果显示,转基因株系在NaCl处理条件下SOS1转录水平会发生不同程度的下降。进一步说明SOS1基因的反向重复片段整合到拟南芥的基因组后已正常转录,并引起了SOS1RNA的降解。耐盐生理指标分析表明:1.在含不同浓度NaCl(0-300mmol/L)的培养基上,SOS1基因的沉默降低了转基因盐芥的耐盐性。2.通过比较各个转基因株系之间耐盐性的差异及SOS1转录的水平,发现SOS1转录水平降低越多,盐芥的耐盐性越差。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
第一部分文献综述  11-26
  1. 植物对Na~+的吸收、转运与细胞离子均衡  11-14
    1.1 Na~+进入植物细胞的途径  11-12
    1.2 Na~+排出植物细胞的途径  12-13
    1.3 Na~+在植物细胞内的区隔化  13
    1.4 Na~+在植物细胞与组织器官内的转移  13-14
  2. 植物的盐害  14-15
    2.1 渗透胁迫  14-15
    2.2 离子胁迫  15
  3. 离子稳态的重建及其调控机制  15-19
  4. 盐芥作为耐盐的模式植物  19-22
  5. 基因沉默  22-26
    5.1 因沉默现象的发现  23
    5.2 基因沉默的分子机制  23
    5.3 dsRNA、siRNA 和MicroRNA  23-24
    5.4 转录后基因沉默技术的应用及展望  24-26
第二部分实验论文  26-44
  一、实验材料及实验方法  26-34
    1. 实验材料  26-27
      1.1 植物材料  26
      1.2 菌种  26
      1.3 酶、化学试剂及试剂盒  26
      1.4 培养基  26
      1.5 质粒提取液  26-27
      1.6 主要仪器设备  27
      1.7 软件  27
    2 实验方法  27-34
      2.1 大肠杆菌感受态的制备及转化  27-28
      2.2 质粒的提取  28
      2.3 盐芥植物材料的种植及处理  28-29
      2.4 植物基因组DNA 的提取  29
      2.5 Basta 抗性苗的PCR 检测  29-30
      2.6 RNeasy Plant Mini Kit 提取植物总RNA 及DNA 酶消化  30-31
      2.7 RNA 的定量  31
      2.8 RNA 的反转录及cDNA 模板的稀释  31
      2.9 实时定量PCR 引物的设计  31-32
      2.10 实时定量PCR (Real Time PCR)  32-33
      2.11 Real Time PCR 数据分析的方法  33
      2.12 野生型植株和转基因植株NaCl 耐性分析  33
      2.13 盐胁迫处理  33
      2.14 Na~+、K~+离子含量的测定  33-34
      2.15 丙二醛(MDA)含量的测定  34
  二、实验结果  34-41
    1 表达载体的构建、验证及盐芥的转化  34
    2 SOS1在盐芥中基因沉默的结果  34-41
      2.1 除草剂FINALE?筛选盐芥抗性苗  34
      2.2 盐芥SOS1基因沉默转基因苗的分子鉴定  34-35
      2.3 SOS1基因沉默的盐芥在盐胁迫条件下的生长情况  35-36
        2.3.1 T_2代转基因苗在MS_0培养基上的筛选  35
        2.3.2 转基因植株在盐胁迫条件下的生长情况  35-36
      2.4 不同的转基因株系盐敏感性的差异以及RNA 水平分析  36-38
        2.4.1 材料处理  36
        2.4.2 总RNA 的提取  36-37
        2.4.3 不同株系SOS1的转录水平及盐敏感性  37-38
        2.4.4 200m M NaCl 处理24 小时后野生型和转基因株系1-10 表达谱的比较  38
      2.5 转基因植株在不同盐胁迫条件下的生长情况  38-39
      2.6 盐处理对转基因植株与野生型植株 Na~+、K~+含量及 K~+/Na~+比的影响  39-40
      2.7 盐处理对转基因植株与野生型植株丙二醛(MDA)含量的影响  40-41
  三、讨论  41-44
参考文献  44-50
致谢  50

SOS1 RNAi对盐芥耐盐性的影响

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